Биотехнология на основе растительных клеток

     В качестве источников углерода используют глюкозу, сахарозу или их смеси. Сахароза не всегда может быть подходящим компонентом среды для культивирования протопластов. В некоторых случаях требуется добавление рибозы, ксилозы, фруктозы, маннозы или других сахаров. Кроме этого в состав питательных сред должны входить такие витамины, как тиамин, пиридоксин и никотиновая кислота. При небольшой плотности высева требуется добавление и других витаминов.

     Маннит, сорбит и их комбинация могут быть использованы в качестве осмотических стабилизаторов.

     В качестве источников органического азота применяют обычно гидролизат казеина, который представляет собой смесь аминокислот. Его добавляют в том случае, если в среде недостаточное количество неорганического азота, а его содержание уже увеличить нельзя.

     Ауксины и цитокинины требуются для клеточного деления и дальнейшего развития растительных клеток. Обычно в качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксус-ную кислоту и нафтилуксусную кислоту, в качестве цитокининов — кинетин, бензиладенин. Оптимальные концентрации варьируют, и их подбирают в каждом отдельном случае.

     Большое внимание при культивировании протопластов уделяется соблюдению и других условий  среды — так, рН среды — 5,4—5,8, температура — 22—28 °С. Иногда требуется  слабое освещение. Жизнеспособность протопластов зависит от начальной плотности высева. Обычно их культивируют при плотности высева от 104 до 106 на 1 мл среды.

     Можно изменять соотношения аммонийного  и нитратного азота в зависимости  от потребности в них клеток, увеличивать  концентрацию СаСl₂ для стабилизации образующейся клеточной стенки. После того как образовались и начали делиться клетки, они могут быть помещены в условия культивирования, применяемые обычно для клеток растений.

     Иногда  для повышения числа делящихся  протопластов в среду добавляют  различное количество кондиционированной среды, на которой некоторое время росли клетки, или же используют так называемый кормящий слой, состоящий из облученных клеток. Клетки в кормящем слое не делятся, но остаются метаболически активными, т.е. продукты жизнедеятельности инактивированных клеток восполняют необходимые компоненты среды. Обычно эти методы применяются в том случае, если протопласты высевают на питательную среду с небольшой плотностью.

     Единичные протопласты можно культивировать в небольших количествах среды в пластмассовых или стеклянных чашках Купрака, а также в микрокамерах. Такое культивирование необходимо для получения колоний из одной клетки и для наблюдения за ее дальнейшим развитием. В последующем при нанесении таких колоний на агаризованную среду определенного состава можно получить каллус, а затем и целое растение.

     В первые сутки культивирования некоторое  число протопластов погибает, что  может быть связано с гетерогенностью  популяции по отношению к действию осмолитиков. Оставшиеся протопласты  уже через несколько часов начинают синтезировать клеточную стенку. Полностью этот процесс завершается при правильно подобранных условиях выделения и культивирования на первые-четвертые сутки. При этом протопласты теряют сферическую форму, клетки удлиняются. Скорость регенерации клеточной стенки зависит от вида растения и ткани, из которой получены протопласты, а также от степени ее дифференцировки. При неблагоприятных условиях выделения и культивирования протопластов клеточные стенки образуются не по всей поверхности. В местах разрывов часть протоплазмы выходит, оставаясь окруженной плазмалеммой. Это так называемые почки. «Почкование» происходит при повышенной концентрации осмотически активных пеществ и при низком содержании СаСl₂.

     Как правило, при благоприятных условиях выделения и культивирования на третьи-четвертые сутки с момента нысева наблюдаются первые деления протопластов. В большинстве случаев затем образуются многоклеточные агрегаты, развивающиеся в дальнейшем в каллус, который способен регенерировать целое растение. Растения-регенеранты из протопластов получены в настоящее время для целого ряда сельскохозяйственных культур. 

     6. Перспективы получения лекарственных  средств на основе клеток растений

     В 60-х гг. XX в. была доказана способность  клеток и тканей растений к росту, делению, органообразованию и вторичному метаболизму, т.е. возможность любой клетки образовывать полноценное растение, поскольку генетический и физиологический потенциал, необходимый для вторичных метаболитов, присутствует в каждой клетке.

     В настоящее время разработано  промышленное получение ряда ценных веществ из растительной биомассы методом in vitro. Хорошо налажен в Японии выпуск следующих лекарственных препаратов: шиконин (из воробейника аптечного), убихинон (из табака), дигоксин (из наперстянки шерстистой), диосгенин (диоскорея дельтовидная).

     Промышленное  производство лекарственных веществ  на основе культур клетки гарантирует  достаточный выход продукта. Это можно подтвердить путем сравнения процента выхода активного начала из биомассы цельного сырья, взятого в эквивалентном количестве.

     Для выращивания культур необходимы высокопродуктивные клетки растения. Так, для культивирования родиолы  розовой более перспективными являются клетки корневой системы.

     Для обеспечения роста и синтеза  продуктов вторичного метаболизма необходим подбор ингредиентов питательной сре-ды, который проводят и оценивают по двум направлениям:

     •влияние  среды на формирование биомассы;

     •влияние  состава среды на синтез вторичных  продуктов.

     Компоненты  субстрата для выращивания культур клеток растений должны включать: основные неорганические питательные вещества, источники железа, органические добавки (витамины, регуляторы роста), источники углерода.

     Существует  несколько стандартных питательных  сред, широко используемых при культивировании, но количество регуляторов роста в них варьирует в зависимости от вида растений. На выход продукта может влиять концентрация источника углерода и других компонентов среды. Так, в культуре клеток барвинка розового увеличение выхода алкалоидов было связано с повышением в среде концентрации сахарозы, а в культуре клеток моркови накопление антоциана стабилизировалось, когда в качестве лимитирующего фактора использовали фосфаты.

     В качестве регуляторов роста и  синтеза продуктов вторичного метаболизма используют ауксины, среди которых индолил-3-уксусная кислота, нафтилуксусная кислота, 2,4-дихлорфенок-сиуксусная кислота, а также цитокины. На синтез вторичных метаболитов влияют внесенные в питательную среду известные предшественники, которые могут стимулировать определенные ферментативные пути метаболизма. Введение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивало выход диосгенина на 100 %. На степень накопления вторичных метаболитов влияют также свет, температура, рН, а при суспензионном культивировании — аэрация и перемешивание, состав питательной среды и концентрации ее компонентов.

     Таким образом, создавая для каждой культуры клеток растений благоприятные условия  на стадии роста и синтеза вторичных  метаболитов, можно гарантировать  получение любого продукта с метаболической активностью.

     Для накопления промышленного сырья  путем выращивания клеток и тканей растений используют каллусные и  суспензионные культуры; последние  получают из каллуса.

     Преимущества  получения ряда фармакологических  веществ на основе культивирования растений заключаются в следующем:

     1. независимость от климатических,  сезонных и географических условий;

     2. стабильность выпуска фарамацевтической  продукции в течение года;

     3. уменьшение площади почвы, на  которой выращиваются лекарственные растения.

     Культуры  клеток растений могут синтезировать  все классы соединений вторичного обмена (алкалоиды, терпеноиды, фенолы, гликозиды, бетаины). Синтез лекарственных веществ  происходит либо во время эксконенциальной фазы, когда наиболее интенсивны метаболические процессы, либо в стационарной фазе развития популяции клеток. Суспензионные культуры — это процесс получения биомассы в течение нескольких десятков суток в биореакторах с постоянным перемешиванием и при соблюдении правил асептики.

     В России разработана технология получения субстанций женьшеня, родиолы розовой, унгерии на основе каллусных культур. Данные препараты нашли применение в медицине, косметологии и пищевой промышленности.

     Выращивание растительных клеток осуществляется в  биореакторах различного объема (до 200 л) с системами перемешивания (турбинное, восходящими потоками воздуха, встряхивание).

     В настоящее время для получения  биомассы и продуктов пторичного метаболизма применяют периодическое  и проточное культивирование.

     Для регуляции процесса проточного культивирования используют хемостатный и турбидостатный методы, т.е. такие подходы, как и при использовании в качестве продуцентом клеток микроорганизмов. Однако для процесса ферментации применяют специализированные типы биореакторов С пневматическим перемешиванием. Наиболее разработаны периодические способы выращивания растительных культур.

     Перспективна  технология получения БАВ с помощью  иммобилизованных клеток, обладающих более низкой скоростью роста  и способностью к интенсивной  выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток — выделение метаболита в питательную среду, из которой он может быть легко извлечен (например, клетки, продуцирующие алкалоиды). Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с суспензионными культурами:

     •многократное использование биомассы;

     •четкое отделение биомассы от продуктов  метаболизма;

     •увеличение продолжительности культивирования  на стадии продуцирования;

     •получение  большого количества вторичных метаболитов.

     Другим  вариантом использования культур клеток растений в фармацевтической промышленности следует считать их применение для биотрансформации.

     Биотрансформация  — метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения, которые способны изменять функциональные группы добавленных извне химических соединений. Он применяется для повышения биологической активности данной конкретной химической структуры и осуществления серии специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов.

     Возможность биотрансформации при синтезе некоторых  соединений была показана на примере  превращения дигитоксина в дигоксин клетками Digitalis lanata (наперстянки шерстистой). Производство этого вещества осуществляется периодическим способом; продолжительность процесса — 17 суток. На первом этапе клетки Digitalis lanata выращивали 10 суток на специальной питательной среде, далее переносили в другую «продукционную» среду (8 %-ный раствор глюкозы с субстратом для биотрансформации — дигитоксином). При соблюдении условий культивирования дигитоксин в течение двух дней трансформировался в деацетиллантозид С (дигоксин) и пурпургликозид. Содержание дигитокси-на — 88 %.

     Производство  серпентина на основе суспензионных  культур частично дифференцированных клеток меристемы Catharatus roseus оказалось эффективным и экономически оправданным лишь после того, как были получены субклоны, способные накапливать за 10-суточный цикл выращивания до 25 г сухого вещества на 1 л суспензионной культуры.

     Аналогичная ситуация имела место и при организации биотехнологического производства настойки женьшеня. Количественный выход биологической субстанции в пересчете на сухое вещество каллуса женьшеня было ниже, чем из женьшеня, полученного при плантационном выращивании, примерно в три-четыре раза.

     Производство  биоженьшеня стало экономически оправданным лишь после того, как  удалось повысить продуктивность его  каллусных культур. Оказалось, что  чем более дифференцированы клетки меристемы в культуре, тем нише их продуктивность. Разработана технология получения в культуре так называемых «бородатых» корней, где по условиям роста в скоплении клеток возникают субпопуляции с повышенной дифференцировкой. Эти популяции являются самыми продуктивными по биологически активным веществам.