Биотехнология на основе растительных клеток

     2. Культура каллусных тканей и их морфогенетические особенности

     Культура  изолированных тканей обычно бывает представлена каллусными или опухолевыми  тканями. Каллусная культура – это  неорганизованная пролиферирующая  ткань, состоящая из недифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные. Каллус может образовываться как на изолированных участках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при повреждении.

     Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зелёного цвета (полная или зональная пигментация антоцианами). Тёмно-коричневая окраска возникает при старении каллусных клеток и вызвана накоплением в них фенолов. Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть различной консистенции:

     1. Рыхлая, состоящая из сильно оводнённых  клеток, легко распадающиеся на  отдельные агрегаты.

     2. Средней плотности, с хорошо  выраженными меристематическими очагами.

     3. Плотная, в которой дифференцируются  элементы камбия и проводящей  системы.

     Обязательным  условием дифференцировки растительной клетки и превращение её в каллусную  является присутствие в питательной  среде двух групп антагонистических гормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процессы дифференцировки клетки, запуская механизмы активизации вторичных мессенджеров, способствующих растяжению клеточных стенок и дальнейшую пролиферацию, а цитокинины вызывают деление уже дифференцированных клеток. Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходим «возврат» к меристематическому состоянию (дедифференцировка). Размножение дифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией митозов, способность к которому была потеряна в процессе дифференцировки.

     Эффект, вызываемый действием одних и  тех же фитогормонов, может быть различным в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени. Её компетентность определяется степенью дифференцировки клеток.

     Переход клетки in vitro из дифференцированного  состояния к дедифференцировке  и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигеномной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений процесс репрессии и дерепрессии генов, лежащий в основе дедифференцировки, происходит легче, чем у однодольных. При переходе дедифференцированной клетки к неорганизованному анархическому размножению, приводящему к образованию каллусной ткани, в клетках происходят биохимические и цитологические изменения. Дедифференцировка начинается с использования запасных веществ и разрушения специализированных клеточных органелл. Через 6—12 ч после индукции дедифференцировки клеточная оболочка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, возрастает число элементов аппарата Гольджи, увеличиваются размеры и число ядрышек. Все эти изменения предшествуют началу делений, которые начинаются через 48-72 часа.

     Каллусная клетка имеет свой цикл развития и  повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и  отмирание клетки. Каллусную дифференцировку  можно назвать вторичной, но её не следует путать с вторичной дифференцировкой клетки, лежащей в основе морфогенеза. Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирание каллусных клеток, первичный каллус, возникший на эксплантах, через 4-6 недель переносят на свежую питательную среду – пассируют. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение нескольких лет.

     Ростовая  кривая каллусных клеток имеет S-образную форму. Данный график включает пять фаз. Во время первой – латентной фазы увеличения числа и массы клеток не происходит. Клетки в этот период подготавливаются к делению. Вторая фаза - период экспоненциального роста, характеризующаяся наибольшей митотической активностью и увеличением массы каллусной культуры. Кроме того, рост здесь происходит с ускорением. Третья фаза – линейная, где скорость роста клеток относительно постоянна. Далее наступает фаза замедленного роста, при которой митотическая активность клеток резко снижается. И пятая фаза – стационарная или период деградации. Скорость нарастания клеточной массы здесь равна нулю.

     Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит от оптимизации  физиологических процессов, обеспечивающих нормальную пролиферацию, их дифференцировку  и регенерацию из них взрослых особей. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизма морфогенеза in vitro, регенерация и лежащих в их основы процессов.

     Каллусные клетки in vitro сохраняют многие физиолого-биохимические  черты, свойственные нормальным клеткам, входящим в состав растительного  организма. Каллусные клетки сохраняют  способность к синтезу вторичных  метаболитов. Морозостойкость и  способность к закаливанию присущи каллусным клеткам, полученным от морозостойких растений. Этим свойством не обладают каллусные ткани, полученные от тропических и субтропических культур. Таким образом, устойчивость к низким температурам сохраняется при переходе клетки к каллусному росту. Каллусным тканям свойственна и фотопериодическая реакция, что связано с сохранением активности фитохромов. Общим у каллусные и нормальных клеток растения является и еще ряд признаков, в частности, устойчивость к действию высоких температур, осмотически активных веществ, засолению.

     Вместе  с тем каллусные клетки обладают отдельными свойствами, отличающими  их от нормальных. В них появляются специфические белки, и уменьшается  количество белков, характерных для  фотосинтезирующих клеток листа, или они совсем исчезают. Каллусные клетки отличаются большой генетической гетерогенностью и физиологической асинхронностью.

     Опухолевые  клетки, в отличие от каллусных, могут  расти на питательных средах, лишенных фитогормонов (ауксина, гетероауксина  и др.), не образуют нормально организованные вегетативные органы. В некоторых случаях из них могут возникать уродливые органоподобные структуры.

     Химический  состав каллуса и ткани органа, из которого он получен, различаются  незначительно. Поэтому каллус можно культивировать на жидких питательных средах с целью получения различных лекарственных соединений в промышленной технологии.

     Регенерация растения из каллуса основана на тотипотентности. Тотипотентность — это свойство соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития с образованием целого организма. Сущность его состоит в том, что если растительная клетка изолируется, она ведет себя подобно клетке зародышевого мешка, т.е. образует эмбриоид и целое растение.

     Тотипотентность культивируемых клеток свидетельствует о том, что генетическая информация сохраняется. Но для ее реализации требуются специфические условия. К факторам, способным полностью или хотя бы частично восстановить замаскированную генетическую информацию, относятся свет, регуляторы роста, предшественники и элементы питания. Стимулирующее действие света на образование вторичных соединений было показано на примере каротиноидов и эфирных масел. Кроме этого важны температура, влажность, освещенность и периодическое обновление питательной среды, так как по мере роста клеток в ней накапливаются продукты метаболизма, что неблагоприятно действует на культуру. Поэтому данная методика связана с пересадками, т.е. с переносом части биомассы на новую питательную среду в другом сосуде («пассажи»). При культивировании растительные клетки имеют более низкие темпы размножения, чем микробиологические объекты, поэтому продолжительность культивирования определяется не десятками часов, а десятками суток.

     Метод выращивания клеток in vitro состоит в том, что растительная, выделенная из любого органа растения, ткань (эксплант) помещается на питательную среду, компоненты которой подбираются так, чтобы они поддерживали нормальную жизнедеятельность клетки и стимулировали деление. Поэтому культивировать эти клетки можно только на сложных питательных средах, содержащих соли азота, калия, магния, фосфора и ряд микроэлементов, из органических веществ — углеводы, аминокислоты, витамины, фитогормоны (кинетин, индолилуксусная кислота).

     Среда Мурасиге и Скуга — наиболее универсальная пригодная для клеток многих двудольных растений. Среда Уайта применяется для андрогенеза в культуре пыльников. Среда Као и Михайлюка используется для культивирования изолированных протопластов. Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Реже используются культивируемые клетки опухолей растений. Клетки опухоли могут делиться на среде без стимуляторов роста, но они не осуществляют в культуре морфогенез и органогенез. 

     3. Суспензионная  культура

     Помимо  культур каллусных клеток в научной практике довольно часто применяются культуры клеточных суспензий и культуры единичных (одиночных) клеток. Для начала рассмотрим суспензионную культуру.

     Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жидкую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Суспензионную культуру получают непосредственно из ткани экспланта. Культура состоит из отдельных клеток и агрегатов, отделившихся от первично образованной каллусной ткани. Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание на качалке (90 – 120 об/мин), роллеров различного типа, или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то пролиферация суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани. Также необходимыми условиями поддержания культуры является аэрация, оптимальные температуры (20-30оС), а также определенный объём и физиологическое состояние инокулюма (часть клеточной суспензии, используемая для переноса на свежую среду). Минимальный объём инокулюма, необходимый для роста культуры, зависит от вида объекта, фазы роста и состава культуральной среды. При слишком больших объёмах рост клеток в суспензии может ингибироваться из-за накопления токсичных продуктов метаболизма, либо из-за недостатка питательного субстрата.

     Начальный момент получения суспензионной  клеточной культуры является рандомическим  событием. Это означает, что только клетки, которые по ряду причин способны к перестройке метаболизма и  размножению с высоким коэффициентом  в данных конкретных условиях суспензионного культивирования, образуют «хорошие» линии. Важными характеристиками иаких линий является высокая степень дезинтеграции (5-10 клеток в группе), морфологическая выравненность клеток.

     Морфологическая вариабельность клеток суспензионных культур не слишком высока: встречаются одиночные растянувшиеся клетки, содержащие огромную вакуоль и пристеночный слой цитоплазмы с крупным ядром; клетки меньшего размер, округлые или овальные, в той или иной степени вакуолизированные, с более плотной цитоплазмой, одиночные или образующие агрегаты.

     Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на средах с 2,4-Д. Исключение из питательной среды ионов кальция  облегчает суспензирование. Ещё  больше облегчает этот процесс добавление в среду пектидазы, способной гидролизировать пектиновые связи в клеточной стенке.

     Кривая  роста клеток в суспензии, как  и клетки каллусной культуры, имеет S--образную форму.

     Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд  преимуществ перед выращиванием каллусных тканей поверхностным способом. Здесь легче и более воспроизводимо влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами. Они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определённых генов, изолирования и характеристик мутантов.

     Работы  по культивированию и субкультивированию проводят в асептических условиях.

     Первичную суспензию перед субкультивированием фильтруют через 1 — 2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных, плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов. Фильтрование рекомендуется и в нескольких последующих субкультивированиях до приобретения клеточной суспензией желательных характеристик. Однако агрегированность суспензии зависит не только от характеристик начальной линии, но и от условий культивирования.

     Способы выращивания, разработанные в микробиологии, применяются для глубинного культивирования растительных клеток. Используются закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. В закрытой системе при периодическом режиме выращивания клеточная масса (инокулюм) помещается в определенный объем среды. До конца выращивания система остается закрытой по всем параметрам, кроме газов. В закрытой культуре в систему периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки при этом остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

     В открытые проточные культуры периодически (или непрерывно) поступает свежая питательная среда, однако отбирается не только старая среда, но и часть  урожая клеточной массы. Регуляция  этого процесса может осуществляться по принципу турбидостата или хемостата. В турбидостате подача свежей среды, и отбор суспензии происходят после достижения клеточной популяцией определенной заданной плотности. Сигнал на включение протока поступает от реле, связанного с оптической системой, определяющей плотность клеток. В хемостате скорость протока задается экспериментатором и от нее зависит скорость роста клеточной массы. Для этого питательная среда лимитируется по одному из наиболее важных для роста факторов, чаще всего по фосфору, азоту или сахару. Режим хемостата позволяет с помощью фиксированной скорости разбавления поддерживать константную скорость деления и плотность клеток в популяции.