Биотехнология на основе растительных клеток

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Реферат по биотехнологии 
 

Биотехнология на основе растительных клеток. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Исполнитель: студентка 5 курса 5 гр. Гречишникова Н.В. 

Руководитель: профес. Ковалева Т.А. 
 
 
 
 
 
 
 
 

ВОРОНЕЖ

2010г.

     СОДЕРЖАНИЕ

стр.

     Введение  ………………………………………………..…………………………….….3

     1. Векторы генетической инженерии растений…………………….………….……...8

     2. Культура каллусных тканей и их морфогенетические особенности……….……...8

     3. Суспензионная культура………………………...……………………….……..…...12

     4. Клональное размножение растений……………………………………….……..…14

     5. Культивирование протопластов……………………………………………….....…19

     6. Перспективы получения лекарственных  средств на основе клеток растений…...21

     Заключение……….………………………………………………………………...…...26

     Список литературы...…………………………………………………………………...28 

Введение

     Клеточная биотехнология базируется на использовании  культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и  создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрёл особое значение в связи с возможностью его использования в биотехнологии.

     Культура  клеток высших растений может рассматриваться  с трёх точек зрения – как уникальная биологическая система, как модель в физиологии растений и как инструмент для разнообразных исследований и биотехнологий. Изолированные растительные клетки способны продуцировать ценные для медицины, парфюмерии и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза (вещества не участвующие в основном обмене веществ): алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и т.д. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Использование изолированных культур клеток в селекции, дают возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды. Вместе с тем, это направление предусматривает создание новых растений путём слияния изолированных протопластов и получение соматических гибридов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами. Культура клеток как экспериментально созданная биологическая система интересна сама по себе и является объектом исследования узкого круга специалистов. Как модель, клетки in vitro представляют интерес для многих физиологов и биохимиков растений. Очевидно, что адекватно использовать культуру клеток как модель можно тогда, когда чётко представляешь её свойства, как биологической системы. И, наконец, как инструмент фундаментальных и прикладных исследований. Статус экспериментально созданной биологической системы обусловлен свойственной культурам клеток изменчивостью, наследуемостью возникших изменений, адаптивным отбором и эволюцией. В некотором роде её можно считать микропопуляцией, основное отличие которой от природных популяций - это отсутствие полового размножения особей, т.е. клеток. Можно выделить две принципиальные особенности культуры клеток растений как биологической системы: во-первых, отсутствие организменного контроля развития, и во-вторых - избыточный генетический материал. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватными моделями для исследований различных направленностей, например метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения. И для более глубокого понимания данных процессов и явлений часто используются методы создания биохимических мутантов, гибридных и трансформированных клеток в пределах исследуемой культуры. Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную массу в асептических, контролируемых по многим параметрам условиях являются преимуществами такого моделирования. В отношении синтеза вторичных метаболитов культуры клеток также обладают рядом достоинств, а именно возможность использования для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию круглый год. Тем не менее, проблемы клеточных и молекулярных основ морфогенеза, не говоря уже о механизмах морфогенеза, остаются малоизученными. Прежде всего, это концепция тотипотентности растительной клетки и её влияние на стратегию исследовательской работы с культурой тканей и клеток растений. Постулат этой концепции о первичности внешнего сигнала в морфогенетическом ответе растительной клетки во многом определил экстенсивный характер исследований в области культуры клеток растений. Второй причиной является сложность морфогенетических процессов, которые позволяют моделировать и изучать культуры клеток и тканей. Известно, что в культуре in vitro может осуществляться реализация нескольких морфогенетических программ, а именно зародышевого развития и некоторого органогенеза. Возможность моделирования в культуре in vitro более простых процессов, например гистогенеза и цитодифференцировок представляется затруднительнее. Однако, в рамках исследования эти проблемы вполне преодолимы, при индивидуальной разработке методики и постановки эксперимента.

     Клеточная инженерия растений рассматривает  различные способы получения  клеточных культур, культивирования растительных и животных клеток, выделения изолированных протопластов, биологического конструирования, а также создания экспериментальных ассоциативных систем между культивируемыми клетками высших растений и микроорганизмами.

     Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный селекционный процесс. Это, прежде всего, следующие технологии: культура семяпочек и зародышей, регенерация растений из тканей летальных гибридов, экспериментальная гаплоидия, криосохранение генофонда, клональное микроразмножение. Клеточная инженерия предлагает новые пути для создания высокопродуктивных форм растений. Это гибридизация соматических клеток, перенос чужеродных генов.

     Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены из других организмов. Процесс  переноса называется генетической трансформацией. Основным преимуществом такой технологии по сравнению с традиционной селекцией является возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип и значительно ускоряет процесс получения новых сортов растений.

     Первое  в мире генно-инженерное химерное растение «санбин» получено в США в результате переноса гена запасного белка бобов фазеолина в геном подсолнечника. В 1984— 1987 гг. получены следующие трансгенные растения: табак, томаты, сельдерей, люцерна, хлопчатник. Внедрение в геном пшеницы генов, детерминирующих животные белки (миозин), может приблизить хлеб по качеству к продуктам животного происхождения.

     Введение  в растение гена, кодирующего белок  тауматин (в 600 раз слаще глюкозы), может улучшить вкусовые качества многих фруктов, не увеличивая содержание углеводов.

     Наиболее  широко используемый метод трансформации  — агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная  бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли  — корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, не нужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, способствующие появлению хозяйственно ценных признаков.

     Впоследствии  был разработан ряд других методов  трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, не чувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них рДНК проникают в геном клеток мишени.

     Признаки, которые возможно придать растениям  с помощью генной инженерии, весьма разнообразны и в основном ограничены только наличием соответствующих генов, причем их можно разделить на три  группы. К первой относится устойчивость к различным факторам окружающей среды — гербицидам, болезням, вредителям, засухе, засолению. Вторая группа представляет интерес непосредственно для потребителей — модификация вкуса и аромата плодов, увеличение продолжительности их хранения, изменение окраски цветов, бессемянность, улучшение питательной ценности растений. В третью группу входят растения-«биофабрики», способные синтезировать вакцины, ферменты, биополимеры и другие биологически активные вещества.

     ДНК Agrobacterium tumefaciens содержат Ti-плазмиды, вызывающие опухоли растений. В геноме агробактерий имеется Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухолей и синтез опинов. Именно этот участок Ti-плазмиды встраивают в ДНК растений. При реконструкции Ti-плазмид, используемых в генно-инженерных проектах, Т-ДНК области заменяют генами, представляющими интерес для человека. Как правило, это целевой ген устойчивости сельскохозяйственных растений к насекомым-вредителям и селективный, который определяет резистентность к определенным веществам (например, антибиотикам). Встраивание этого гена позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как обычные клетки в ней гибнут. Иногда включают репортерный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например по окрашиванию или свечению в ультрафиолетовом свете.

     Процесс селекции генно-инженерных сортов растений заключается в следующем. В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты), из которых легче всего регенерировать растения (чаще всего используют меристему). Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерий с помощью специальных белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в геном растительной ткани. Затем ее помещают в питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерий перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам. Условия и состав среды подобраны таким образом, что трансформированные клетки активно размножаются, образуя неорганизованную массу делящихся клеток (каллус), из которых путем клонального микроразмножения регенерируют трансгенные растения. Полученные растения размножают и подвергают различным анализам сначала в пробирке, а потом — на полях и в теплицах.

     В США выращиваются трансгенные растения рапса, сои, хлопчатника, устойчивые к  гербицидам, созданы трансгенные томаты, содержащие гены вируса табачной мозаики, благодаря чему они устойчивы к другим вирусам.

     Генно-инженерными  методами в геном растения вводятся гены, кодирующие белки, токсичные для  многих насекомых. Так получают сорта  растений, устойчивые к вредителям. Генетическая инженерия решает проблему искусственной пищи. Уже сейчас в микроорганизмы вводятся гены, управляющие синтезом незаменимых аминокислот, ставится задача создания штаммов дрожжей, бактерий, вырабатывающих пищевые белки, причем культивировать их предполагается на отходах сахарной промышленности.

     Клеточная инженерия позволяет получать сорта растений в контролируемых условиях, а также фармацевтические препараты (убихинон-10 — табак, ятрорризин — барбарис, шиконин — воробейник).

     1. Векторы генетической инженерии растений

     Основными типами культивируемой растительной клетки являются каллусные и опухолевые клетки. Каллусная ткань появляется у растений в исключительных условиях (травмах) и функционирует непродолжительное время, накапливая питательные вещества для анатомической регенерации.

     В настоящее время в генно-инженерных проектах используют векторы на основе Ti-плазмид, транспозируемые элементы и вирусы растений.

     Природная Ti-плазмидная система переноса генов  в растениях нуждается в модификации, прежде чем она может быть использована. Универсальная векторная система на основе Т-ДНК должна:

     а) содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции ее в ядерную ДНК растения, а также систему для экспрессии передаваемых в растение генов и маркер, который способствует селекции трансформируемых клеток;

     б) характеризоваться простым способом введения чужеродной ДНК в вектор.

     При конструировании векторов для введения чужеродных генов в клетки растений в настоящее время используют РНК-содержащие вирусы растений (например, вирус мозаики цветной капусты) и вириоиды, содержащие одноцепочечную низкомолекулярную кольцевую РНК (150—170 кДа), способные реплицироваться автономно от генома реципиента.

     При селекции новых генно-инженерных сортов растений используют плазмиды Agrobacterium tumefaciens, ковалентно связанные с хлоропластнои или митохондриальной ДНК. Так получают челночные векторы, которые являются наиболее перспективным направлением надежных, хорошо воспроизводимых результатов по генетической трасформации растений и новых высокопродуктивных сортов, культивируемых в условиях интенсивной агротехники