Биотехнология на основе растительных клеток

     Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными  лекарственными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим, суспензии клеток можно применять в качестве исходного материала для получения изолированных протопластов. Для промышленного получения продуктов вторичного синтеза из больших клеточных масс используют ферментеры большой емкости (от 20000 и более литров), в которых проводят непрерывное культивирование клеток. Суспензионные культуры могут быть не только источником ценных вторичных метаболитов, но в них выявлены также другте соединения, например, камптотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др. Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в стационарной фазе роста. 

     4. Клональное микроразмножение растений

     Клональное  микроразмножение — это использование  техники in vitro для быстрого размножения растений, идентичным исходному, неполовым путем.

     Клон  — это совокупность клеток или  особей, произошедших от общего предка путем бесполого размножения  — основная единица учета в  генетике микроорганизмов. В основе образования клонов лежит митоз, поэтому считается, что клон состоит из генетически однородных клеток. Однако это весьма относительно из-за спонтанных мутаций. Только клонированием удается сохранить особенности сорта. Клональное микроразмножение растений путем выращивания их из одной клетки на основе тотипотентности клеточной культуры обладает рядом преимуществ и является чрезвычайно перспективным:

     1. Коэффициент клонального размножения  гораздо выше, чем при обычных  методах размножения. Так, из  одного растения герберы в год можно получить 50—100 растений обычным способом, при клональном размножении из культуры ткани — до 1 млн.

     2. Можно размножать растения круглый  год.

     3. Тысячи растений могут расти  на относительно небольшой лабораторной  площади.

     4. Одновременно с размножением происходит и оздоровление растений (от вирусов и патогенных микроорганизмов).

     5. Методом клонального размножения  получают посадочный материал  растений, которые медленно размножаются  половым путем или совсем не  размножаются вегетативно.

     6. При клональном размножении, в отличие от полового, получают генетически однородное потомство. Различают два вида клонального размножения:

     •маломасштабное (при селекционных работах);

     •массоклональное, коммерческое размножение с целью  освобождения от вирусов и получения оздоровленного посадочного материала.

     Следует назвать еще две области применения клонального микроразмножения. Первая — это клональное микроразмножение лучших экземпляров лесных деревьев, особенно хвойных. Вторая — это использование  техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов растений, которые могут сохранять генетическую стабильность на всех этапах клонального микроразмножения — от экспланта до растения в поле. Меристемные ткани растений непрерывно поддерживаются в эмбрионально активном состоянии, устойчивы к генетическим изменениям вследствие высокой активности систем репарации ДНК. При использовании в качестве эксплантов дифференцированных тканей растений возможно появление мутантных форм, поэтому апикальная меристема и пазушные почки стебля являются наиболее предпочтительными объектами клонального микроразмножения. Все манипуляции при клональном микроразмножении растений осуществляются в асептических условиях, т.е. с соблюдением техники микробиологических работ. Работа проводится или в микробиологических боксах, облучаемых УФ-светом, или в ламинарбоксах, где асептика достигается подачей стерильного воздуха.

     Процесс клонального микроразмножения имеет  продолжительность около трех месяцев  и его можно разделить на четыре этапа.

     На  первом этапе осуществляют выбор растения-донора, изоляцию и стерилизацию экспланта и создание условий для образования каллуса на твердой питательной среде.

     Второй  этап связан с увеличением числа  инициалей на каллусе и формированием  побега.

     Третий  этап — укоренение размножаемых пробирочных растений и адаптация их к условиям in vitro.

     Четвертый этап — выращивание извлеченных  из пробирок растений в теплице и  закалка перед высаживанием в  поле.

     При отборе растений — доноров экспланта  следует учитывать условия их предварительного выращивания, так как они могут существенно влиять на рост экспланта в культуре (добавки искусственных удобрений, время года). Необходимо отбирать и соответствующую стадию развития. Незрелые ткани и органы более способны к морфогенезу, чем зрелые. Двудольные травянистые растения обладают значительно большей регенерационной способностью, чем однодольные. Экспланты, изолированные в фазу активного роста, более склонны к укоренению и образованию побегов, чем изолированные в фазе покоя.

     После отбора экспланта следует обратить особое внимание на дезинфекционную обработку растений, необходимую для удаления микроорганизмов с поверхности растений. Наличие любого загрязнения влияет на формирование каллуса. Прежде всего орган растения, из которого берут эксплант, моют мылом и водой (корни). Если берут листья, то их моют водным раствором мягкого детергента.

     Установлено, что меристема сердцевины луковиц, клубнелуковиц, корневищ надежно защищена и является стерильной. Открытые органы растений — источники эксплантов подвергают стерилизации химическим способом.

     Стерилизующий эффект можно повысить следующим  образом: стерилизация под вакуумом для удаления пузырьков воздуха; помещение экспланта в 70 %-ный  этанол перед стерилизацией дезинфектантом. После отмывки стерильной водой эксплант помещают на стерильную питательную среду в пробирки.

     Как правило, для клонального микроразмножения на первом и втором этапах используют среду Мурасиге и Скуга, варьируя состав и сочетание стимуляторов роста в зависимости от объекта.

     На  первом этапе возможно ингибирование ростовых процессов экспланта токсическими веществами, выделяемыми в среду. В результате травмы, полученной эксплантом при изолировании, активируются фенолазы, окисляющие фенолы растений, продукты окисления которых ингибируют деление и рост клеток. Поэтому в питательную среду на первом этапе вводят антиоксиданты (глютатион, аскорбиновую кислоту, иногда антибиотики) и первые 4—5 дней культуру держат в темноте.

     Условия культивирования экспланта (60—100 мг) характеризуются определенной температурой (25 °С), для субтропических растений — 29 °С, каллус может расти в темноте, но можно его выращивать и на свету. Дальнейшие стадии культивируют при интенсивном освещении при длине светового дня 16 ч.

     В последние годы фирма «Sigma» (США) выпускает новые мембранные наборы для культур растительных тканей из микропористой полипропиленовой мембраны, обработанной специальными поверхностно-активными веществами для улучшения прохождения питательных веществ. С применением мембран существенно ускоряется рост растений и каллуса по сравнению с агаризованной питательной средой, лучше удается освобождать культуры от ингибирующего влияния фенолов, выделяющихся в среду. Для развития и формирования каллуса важную роль играют элевиторы — биологически активные вещества, активизирующие клеточное деление и ускоряющие дедифференцировку каллуса на первом этапе. Полагают, что они образуются из гидролизованных гликанов клеточных стенок.

     На  втором этапе очень важно создать  оптимальные условия для митотического  деления. Полученный каллус, как правило, состоит из неодинаковых по размеру клеток паренхимного типа. Для него характерно появление меристематически активных отдельных клеток или целых групп, предшественников корней и побегов. Образование и размножение каллуса происходит 4—16 недель. Далее его можно расчленить и размножить на той же среде с добавлением 6-бензиладенина с целью получения побегов.

     Инкубация на втором этапе клонального микроразмножения осуществляется при 16-часовом световом дне и температуре 25—29 °С; побеги формируются через 3—5 недель. Условия должны обеспечить быстрое размножение экспланта в течение длительного процесса культивирования. Основную роль при этом играет оптимальное соотношение стимуляторов роста цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют 6-бензиламинопурин (1—10 мг/л), из ауксинов — β-ИУК (β-индолилуксусную кислоту 0,5 мг/л).

     На  третьем этапе (укоренение побегов) осуществляют пересадку побегов  на агаризованную питательную среду. Образования придаточных корней можно добиться различными способами. Корнеобразование усиливается при добавлении в среду хлорогеновой и феруловой кислот. Придаточные корни легко образуются на культивируемых побегах после введения ауксина. Корнеобразование может подавлять высокая интенсивность света, поэтому нижнюю часть пробирок следует закрывать фольгой. Укоренение можно индуцировать, поместив проросток в нестерильные условия грунта с высокой влажностью.

     При подготовке растений к высадке в  грунт они должны иметь длину 10—15 см. Выращивание осуществляется путем ряда пересадок (через 4—8 недель) на новые питательные среды. Для переноса в почву отбирают крепкие здоровые растения-регенеранты. Интактные проростки переносят в дистиллированную воду на 10—15 мин, затем во избежание дегидратации и для удаления остатков питательной среды их трижды промывают дистиллированной водой, опрыскивают раствором фунгицида и переносят в пластмассовые или торфяные горшочки, содержащие стерильный моховой торф. В течение 1—2 месяцев растения поливают через день дистиллированной водой и питательным раствором. Проростки инкубируют при высокой освещенности и при длине светового дня 16 ч, температуре 25—29 °С. Через два месяца с растениями уже можно обращаться как с обыкновенными проростками. Процесс регенерации длится около трех месяцев.

     Получение растений через органогенез можно  осуществить тремя способами:

     1. путем формирования придаточных  органов на каллусе, полученном  из экспланта;

     2. путем формирования придаточных  органов прямо из экспланта  без промежуточной фазы каллусообразования;

     3. путем формирования растений-регенерантов  из побегов, образовавшихся из  набухших почек.

     Сейчас  клональное микроразмножение разработано  для 2400 видов растений на лабораторном уровне. Однако в мире работают более 130 коммерческих лабораторий, не считая тех, которые занимаются размножением орхидей. Потребности мирового рынка .удовлетворяются на 20 %. В нашей стране развиваются лаборатории, связанные с нуждами селекции, а также с производством посадочных клубней картофеля, винограда и земляники на безвирусной основе.

     Основные  недостатки клонального микроразмножения растений:

     1. Большая трудоемкость и высокие  затраты. Необходима автоматизация  и принципиально новые приемы. Среди них можно назвать отказ  от укоренения растения in vitro и  привлечение гидро- и аэропоники. В дальнейшем прогресс будет связан с автоматизацией и роботизацией трудоемких процедур.

     2. Все особи, полученные путем  клонального размножения, происходят  из единственной  меристемы и  обладают уменьшением генетического  разнообразия. Новые болезни могут оказаться для них катастрофическими за счет одинаковой восприимчивости к патогенным микроорганизмам.

     Поэтому наряду с развитием техники вегетативного  размножения на основе культуры меристематических клеток необходимо иметь и коллекции семян для сохранения генотипов п поддержания генетического разнообразия. 

     5. Культивирование протопластов

     Протопласты высевают как на жидкие, так и  на агаризованные среды того же состава  с различными концентрациями агара.

     Основное  требование к применяемым методам состоит в том, чтобы в процессе культивирования не происходило разрушения протопластов и среда была оптимальна для образования клеточных колоний. До тех пор, пока протопласты не образовали клеточную стенку, они представляют собой легко разрушаемые структуры, и работа с ними должна проводиться в мягких условиях.

     Условия культивирования протопластов, в  основном, соответствуют тем, которые  применяются для выращивания  в культуре клеток растений.