Шпаргалка по "Генетика"

21. Изучение спонтанного  мутационного процесса

Спонтанный мутагенез, т.е. процесс возникновения мутаций  в организме в отсутствие намеренного  воздействия мутагенами, представляет собой конечный результат суммарного воздействия различных факторов, приводящих к повреждениям генетических структур в процессе жизнедеятельности  организма.

 

Причины возникновения спонтанных мутаций можно разделить на:

• экзогенные (естественная радиация, экстремальные температуры  и др.);

• эндогенные (спонтанно  возникающие в организме химические соединения-метаболиты, вызывающие мутагенный эффект; ошибки репликации, репарации, рекомбинации; действие генов-мутаторов и антимутаторои; транспозиция мобильных генетических элементов и др.).

 

Организм человека за год  поглощает в среднем 0,095 рад энергии  ионизирующих излучений, поступающих  от естественной радиации (у-излучение  Земли, космические лучи, радиоактивные  элементы земной коры и атмосферы  такие, как радон, углерод С , калий К40 и др.). Эта доза зависит от высоты над уровнем моря и географической широты. Кроме того, радиация выше в районах, где есть выходы на поверхность первичных пород. У человека доля мутаций, индуцированных естественной радиацией составляет до 25%, а у дрозофилы —лишь 0, 1% всех спонтанных мутаций.

 

Относительно УФ-излучения выше уже было указано, что оно практически не играет никакой роли в возникновении мутаций в половых клетках эукариот, не обладая достаточной проникающей способностью. В то же время, у одноклеточных организмов и вирусов под действием ультрафиолета образуется значительная часть спонтанных мутаций.

Замечено, что в высокогорных, а также арктических условиях растительность представлена преимущественно  полиплоидными формами, так как  резкие перепады температур в период вегетации растений ведут к увеличению частоты спонтанных геномных мутаций. Увеличение температуры окружающей среды на каждые 10 °С увеличивает частоту мутаций в 5 раз.

 

Основным источником спонтанных мутаций служат эндогенные факторы, приводящие к повреждению генов  и хромосом в процессе нормального  клеточного метаболизма. Результат  их действия — ошибки генетических процессов репликации, репарации  и рекомбинации.

 

Ошибки репликации:

• таутомерные переходы азотистых оснований приводят при репликации к спонтанным транзициям и трансверсиям;

• ошибки в работе ДНК-полимераз  обусловливают некомплементарное встраивание 1 на 100000 вновь синтезирующихся нуклеотидов. Корректорская 3'-5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимераз снижает эту частоту до 1 на 10000000000;

• химические модификации  оснований (например, при встраивании 5-метилцитозина происходит замена GC - AT, т.к. 5-метилцитозин при последующей  репликации может образовывать водородные связи с аденином).

 

Ошибки репарации:

• например, мутации в  гене uvrD, отвечающем за репарацию одноцепочечных разрывов при УФ-облучении Е.сой\ в сотни раз повышает частоту спонтанных транзиций AT — GC.

 

Ошибки рекомбинации:

• в результате неравного  внутригенного кроссинговера в мейозе происходят вставки либо выпадения оснований.

 

К эндогенным факторам спонтанного  мутагенеза относится и мутагенная активность специальных элементов  генома: генов-мутаторов и эндогенных метаболитов. Так генетическая стабильность большинства генов определяется не только особенностями их строения, но и уровнем общей мутабильности клетки, контролируемой генами-мутаторами и антимутаторами, которые по-видимому, задействованы в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК. К классу эндогенных метаболитов относятся спонтанно возникающие химические соединения, вызывающие мутагенный эффект. Например, при заживлении физических травм у растений, образуются каллусные клетки, которые в норме отсутствуют, при этом индуцируется синтез дополнительных ферментов и метаболитов, необходимых для заживления раны. Если в каллуснои ткани возникают почки, то часть побегов из этих почек оказываются полиплоидными, т.е. метаболиты каллуснои ткани способны вызывать геномные мутации. Мутагенным эффектом обладают и свободные радикалы, возникающие при перекисном окислении липидов клеточных мембран.

 

Среди структурных факторов, определяющих эндогенные механизмы  мутагенеза, можно выделить такие;

• наличие прямых и обратных повторов вблизи места перестройки;

• высокая концентрация CpG-динуклеотидов;

• наличие внегенных последовательностей ДНК, гомологичных фрагментам структурного гена;

• мобильные элементы генома.

 

Два первых фактора реализуются  в процессе репликации ДНК хромосом, третий — в процессе рекомбинации.

 

Вследствие скользящего  нарушения спаривания (slipping mispairing) родительской и дочерней цепей ДНК при репликации нередко образуются петли. Их формирование обусловлено наличием в первичной структуре ДНК прямых и инвертированных повторов, идентичных повторяющихся последовательностей, структур шпилечного типа, квазипалиндромных последовательностей и симметричных элементов генома (например, CTGAAGTC). Эти петли либо исчезают в результате репарационного процесса (и тогда возникают делеции), либо сохраняются и приводят к дупликациям и ин-серциям; при этом сформировавшиеся изменения закрепляются в последующих циклах репликации. Именно в последнем случае возможно появление мутации экспансии.

 

Возникновение мутаций зависит  от особенностей первичной структуры  ДНК в месте перестройки, и  ряд исследователей полагают, что  повышенной эндогенной мутагенностью  обладают вообще все последовательности ДНК, находящиеся в состоянии изгиба (bens DNA). Именно такая конформационная структура ДНК свойственна: промоторным частям генов, местам начала репликации (origins of replication), месгам контакта хромосом с ядерным матриксом, т.е. тем участкам ДНК, на которые воздействуют топоизомеразы, участвующие в процессах репликации, транскрипции, рекомбинации, в том числе, и негомологичной (незаконной). Результатом последней могут быть не только внутри генные мутации, но и крупные структурные перестройки хромосом (транслокации, инверсии и др.).

 

Наиболее распространенные спонтанные нарушения ДНК в ходе репликации и репарации - потеря оснований  и дезаминирование, к которому особенно чувствительны цитозиновые остатки. В настоящее время показано, что у позвоночных почти половина всех цитозиновых остатков в ДНК метилирована в 5-м положении, в областях повторов 5'-CpG-3'. При дезаминировании 5-метилцитозин превращается в тимин. При последующей репликации возникший в результате деза-минирования ошибочный вариант (T-G) либо корректируется (C-G), либо приводит к мутациям типатранзиций; (T-G) или (С-А). Гены, имеющие в своей структуре большой процент CpG-оснований, спонтанно мутируют по типу транзиций особенно часто. Таковы, например, ген фенилаланингидроксилазы у больных фе-нилкетонурией, гены факторов VIII и IX свертывания крови и др.

 

Еще одна существенная причина  эндогенного мутагенеза — наличие  псевдогенов -тесно сцепленньгх с генами гомологичных последовательностей ДНК. В мейозе результатом такой структурной особенности может быть неравная гомологичная рекомбинация и, как следствие - генная конверсия, сопровождающаяся делениями, дупликациями и другими перестройками. Так, очевидная ключевая рольошибок рекомбинации вэтио-логии нарушений структуры была установлена при анализе гигантского по размерам (2,2 млн, п.н.) гена дистрофина, мутации которого (в 60% случаев являющиеся делециями) ведут к миопатии Дюшенна. Подавляющее большинство этих делеций, захватывающих один или несколько соседних экзонов, сосредоточено в двух «горячих» районах. Наблюдаемая частота внутригенных рекомбинаций почти в 4 раза выше, чем можно предполагать, исходя из размеров генадистрофина. В одной из этих «горячих» точек (интрон 7) недавно обнаружен кластер транспозоноподобных повторяющихся последовательностей. Единичные пока наблюдения свидетельствуют о реальном перемещении этих элементов по типу конверсии и об их интеграции в структурные гены аденозиндезаминазы, аполи-попротеина С, факторов VIII и IX свертывания крови, кальмодулина.

22. Определение  частоты мутации

Определение частот спонтанных мутаций организмов разных видов  проводят с помощью разных способов, один из которых связан с определением частоты таких мутаций на репликацию пары азотистых оснований в молекулах  ДНК. Этот способ оказался предпочтительным в случае бактерий и других низших организмов.

Определенные к настоящему времени частоты мутаций на репликацию пары оснований и общие частоты  генных мутаций у разных организмов показаны в табл. 13.

В случае человека частоты  спонтанных мутаций определяют измерением прямых мутаций в пределах разных генов, которые очень чувствительны  к мутациям независимо от того, являются ли условия для организмов ограничивающими  или селективными.

Рассмотрим конкретный пример определения частоты спонтанных мутаций, например, среди родившихся за один год 242 257 детей 7 оказались больными ахондоплазией. Следовательно, 7 : 242 257´1 : 2 (два аллеля на зиготу) = 1,4´10-6. Таким образом частота ахондоплазии составляет 1,4 х 10-5. Одни гены вообще устойчивы к спонтанным мутациям, другие спонтанно мутируют чаще, третьи так часто, что их носители являются мозаиками мутантных (мутировавших) и немутантных (немутировавших) генов.

Средние частоты мутаций  по многим генам у человека и домашних животных составляют примерно 1´10-9, что  значительно выше частоты мутаций  микроорганизмов. Больше того, между  частотами спонтанных мутаций по разным генам человека или домашних млекопитающих существуют значительные различия, достигающие 100 раз, а то и  более. Подлинные причины этих различий неизвестны, хотя для их объяснения и предложено несколько гипотез. Одна из них заключается в том, что наиболее чувствительны к  мутациям гены больших размеров, поскольку  в них содержится много азотистых  оснований и существует большая  вероятность мутации отдельных  из них. По другой гипотезе наиболее чувствительными  к мутациям являются гены, располагающиеся  в районах хромосом, являющихся «горячими» точками.

 

Уже давно установлены  гены, которые оказывают влияние  на мутабельность других генов. Такие гены получили название мута-торных генов. Они содержатся в геноме организмов почти всех изученных генетически к настоящему времени видов.

Определение частот спонтанных мутаций позволяет определить вероятность  мутаций в каждом новом поколении  людей: 1´10-6 мутаций на ген х 5 х 10~4 генов (гаплоидный геном) = 5´10-2 мутаций  на гамету (5 : 100 или 1 : 20). Далее, 1 : 20´2 гаметы на зиготу = 1 : 10 случаев, что каждая гамета несет новую мутацию. Возможно, что это очень высокая частота, но ее достоверность определяется тем, что большинство мутаций рецессивно и, следовательно, не экспрессируется у гетерозигот.

23. Получение ауксотрофных мутантов и их идентификация

Mетод выделения ауксотрофных мутантов в культуре бактерий дикого типа: заключается в добавлении пенициллина в минимальную среду <minimal medium> на 1 час, в результате чего выживают только нерастущие ауксотрофные мутанты, для выделения которых (с одновременным удалением пенициллина) используют фильтрацию (или добавление фермента пенициллиназы).

Однако основной путь селекции продуцентов аминокислот — получение  ауксотрофных и регуляторных мутан­тов. Ауксотрофные мутанты отбирают на селективных средах после воздействия на суспензии бактериальных культур физи­ческими (например, ультрафиолетовое или рентгеновское излуче­ние) и химическими (этиленимин, диэтилсульфат, нитрозоэтил- мочевина и т. д.) факторами. У таких мутантов появляется де­фектный ген, детерминирующий фермент, без которого не может осуществляться биосинтез определенной аминокислоты. Получе­ние ауксотрофных мутантов — продуцентов аминокислот — воз­можно только для микроорганизмов, имеющих разветвленный путь биосинтеза, по крайней мере, двух аминокислот, образую­щихся из одного предшественника. Их биосинтез контролиру­ется на уровне первого фермента общего участка согласованным ингибированием конечными продуктами (ретроингибирование). У таких ауксотрофных мутантов избыток одной аминокислоты при дефиците другой не приводит к подавлению активности первого фермента. Аминокислота, биосинтез которой блокиро­ван в результате мутагенного воздействия, должна добавляться в ограниченном количестве. Регуляторные мутанты отбирают среди культур, устойчивых к аналогу целевой аминокислоты. С этой целью исходный штамм (часто это ауксотроф) высевают газоном на минимальную среду, содержащую источник углерода, неорганические соли и аналог целевой аминокислоты. Последний действует на регуляторную систему клеток, имитируя избыток соответствующей природной аминокислоты, антагонистом которой он является; обычно вклю­чаться в белок аналог не может, и, следовательно, рост куль­туры прекращается. Этот метод позволяет отобрать мутанты, у которых имеются нарушения в системе регуляции образования целевой аминокислоты, а некоторые из них оказываются способ­ными к ее повышенному синтезу и выделению из клетки. За последние годы в селекции продуцентов аминокислот ак­тивно начали использовать методы генной инженерии, позволяю­щие повышать дозу генов биосинтеза аминокислот путем их клонирования на плазмидах. Трансформируя гибридные плазми- ды в клетки, удается повысить дозу генов и, следовательно, ко­личество ферментов, ответственных за биосинтез соответствую­щей аминокислоты. Рассмотрим биосинтез отдельных аминокислот и способы се­лекции некоторых культур, приводящих к сверхсинтезу целевых продуктов. L-Глутаминовая кислота — первая аминокислота, полученная на основе промышленного микробиологического синтеза. В ка­честве продуцентов брали дикие штаммы глутаматпродуцирую- щих коринебактерий. В условиях, обеспечивающих нормальный рост этих культур, сверхсинтеза этой аминокислоты не проис­ходит. «Перепроизводство» этого продукта дикими штаммами коринебактерий вызывается особыми физиологическими условия­ми, когда рост клеток тормозится, а в клеточной мембране происходят структурные и функциональные изменения, приво­дящие к проницаемости ее для глутаминовой кислоты. Такие условия создаются при лимите в среде биотина (1—5 мкг/л). Подобный эффект наблюдается при добавлении к среде куль­тивирования некоторых антибиотиков и детергентов. В резуль­тате интенсивного выделения из клетки образуемой глутамино­вой кислоты ее внутриклеточная концентрация резко снижается и регуляция синтеза конечным продуктом ослабевает. В таких условиях даже дикие штаммы способны превращать в глутами- новую кислоту до 50% используемого источника углерода. Селекционная работа с продуцентами этой аминокислоты идет главным образом в направлении получения ауксотрофных мутантов, отличающихся слабой активностью а-кетоглутарат- дегидрогеназы (фермента, включающего предшественник глут­аминовой кислоты в цикл трикарбоновых кислот), регуляторных мутантов, характеризующихся слабой чувствительностью L-глу- таматдегидрогеназы к ингцбированию конечным продуктом, и му­тантов, способных ее продуцировать в присутствии увеличенных количеств биотина. Основной селекционный прием — ступенчатый отбор после мутагенного воздействия и оценка мутантов на средах с повышающимся содержанием биотина (до 30 мкг/л). Такие штаммы необходимы в связи с применением в производст­ве мелассных сред, содержащих высокие концентрации биотина. Один из полученных в СССР мутантов способен накапливать в культуральной жидкости свыше 50 г/л глутаминовой кислоты, используя мелассу как единственный источник углерода, и не требует введения поверхностно-активных или других веществ, повышающих проницаемость биомембран. Японские исследователи проблему получения глутаминовой кислоты на мелассных средах решают другим путем — получе­нием мутантов, у которых накопление аминокислоты контроли­руется температурным режимом. ТемпературочувствитЁльные му­танты имеют нарушения в структурах клеточной мембраны, проявляющиеся при повышении температуры культивирования до 40°С и приводящие к выделению глутаминовой кислоты из клетки. Температурозависимые мутанты накапливают 20—26 г/л глутамата на средах с мелассой.

24. Изучение выживаемости  и частоты мутации

Мутации в отличие от репарируемых повреждений ДНК — сравнительно редкие события. При расчете на единичный ген одна из каждых 100 000-1 000 000 гамет содержит вновь возникшую мутацию. Однако для генотипа в целом мутация — явление совсем не редкое: если принять число генов у человека равным 50 ООО, то получается, что значительная часть гамет имеет новую мутацию. Большая часть мутаций резко нарушает жизнеспособность клетки: в результате мутаций гибнет до 80 % гамет на самых ранних стадиях развития.

Частоту мутаций, сохранившихся  в процессе эволюции, можно оценить  по различиям первичной структуры  какого-либо белка у разных животных. Например, известна первичная структура  цитохрома с примерно 100 разных видов организмов. Сравнивая число аминокислотных замен в цитохроме с некоторых видов по сравнению с цитохромом с человека (табл. 5.1), легко видеть, что различия тем больше, чем меньше филогенетическое родство. Зная время, потребовавшееся для эволюции, например от земноводных до млекопитающих, можно рассчитать частоту замен. Для цитохрома с она оказалась равной трем заменам за 100 млн лет; для других белков получены величины от 0,2 до 60 замен за 100 млн лет. Конечно, эти величины отражают лишь незначительную часть всех мутаций, поскольку большинство из них являются вредными и элиминируются в ходе естественного отбора. Отметим также, что при таком методе определяется частота мутаций одного гена, а не всего генома.

25-27 Опасность ГМО

Некоторые ученые высказывают  опасения, что ГМО могут представлять опасность для здоровья людей, в  связи с тем, что они, возможно:

 

увеличивают риск возникновения  пищевых аллергий и отравлений;

способны вызывать мутации;

способствуют образованию  опухолей;

вызывают невосприимчивость  к антибиотикам.

Существует определенная вероятность, что чужеродная ДНК  способна накапливаться в организме  человека, а также попадать в ядра клеток эмбрионов, что может привести к врожденным уродствам и даже гибели плода.

 

В группу риска попадают дети до 4-х лет, т. к. они меньше всего  защищены от воздействия чужеродных генов.

 

Аллергенность ГМО

Более половины трансгенных  белков, обеспечивающих устойчивость растений к насекомым, грибковым  и бактериальным заболеваниям токсичны и аллергенны и для человека и/или  млекопитающих.

 

Многие дети в США и  Европе заболели угрожающей жизни аллергией  на арахис и другие продукты. Существует возможность, что введение гена в  растение может создать новый  аллерген или вызвать аллергическую  реакцию у чувствительных людей.

 

Предложение включить ген альбумина из бразильских орехов в сою было отклонено из-за страха вызывать неожиданные аллергические реакции.