Шпаргалка по "Генетика"

3. Определение последовательности  генных локусов вдоль хромосомных  пар.

4. Выяснение тонкой структуры  и секвенирование ДНК генов.

Результаты генетического  анализа оформляют путем со-ставления генетических карт.

Одним из важнейших показателей  эффективности генети-ческого анализа является его разрешающая способность, кото-рая в общих чертах может быть аналогизирована с разрешаю-щей способностью оптических методов исследования. Подобно тому, как последняя ограничена волновой природой света, раз-решающая способность генетического анализа ограничивается количеством особей исследуемого потомства, получаемого в скрещиваниях, поскольку чем многочисленнее потомство, тем больше вероятность обнаружения в них редких рекомбинантов и, следовательно, правильного определения частоты кроссинго-вера.

Разрешающая способность  генетического анализа всегда имеет  ограничения, поскольку возможность  получения большо-го потомства всегда лимитирована даже у тех видов, у которых численность его составляет сотни организмов на пару, как, например, у Drosphila melanogaster. Поэтому у организмов, раз-множающихся половым путем, реально выполнение лишь трех первых этапов генетического анализа и части второго (секвени-рование).

При попытках повысить разрешающую  способность гене-тическо¬го анализа было установлено, что половая репродукция не единст¬венный путь, при котором осуществляется объедине-ние, расщепле¬ние и рекомбинация генетических структур, про-исходящих от исходных (родительских) организмов. Эти про-цессы могут иметь место при других формах обмена генетиче-ским материалом. Например, у микроорганизмов такими фор-мами являются трансформация, коньюгация и трансдукция бак-терий, а также парасексуальный цикл у низших грибов. Поэтому генетический анализ основывается и на таких формах генетического обмена. Несмотря на частные различия между разными формами обмена генетическим материалом у микроорганизмов, общим для них по сравнению с половой репродукцией высших организмов является то, что они приводят к объединению в одной клетке родительских генов и обеспечивают их расщепление, и рекомбинацию, т.е., будучи альтернативами половой репродукции, представляют собой системы рекомбинации.

Использование названных  выше систем рекомбинации привело к  очень значительному повышению  разрешающей спо-собности генетического анализа, так как появилась возможность оперировать огромным количеством организмов в потомстве, а также легко осуществлять тесты комплементации. Это позволило не только составить подробные генетические карты ряда организмов (кишечная палочка, палочка мышиного тифа, фаги, низшие грибы), но и изучить тонкое строение их генов.

Однако генетический анализ высших организмов тех ви-дов, у которых между генерациями проходит длительное время и пара родителей имеет небольшое потомство, либо вообще не-осуществим, либо очень затруднен. Из-за невозможности прове-дения классического генетического анализа этих организмов их наследственность изучают с помощью других методов. Напри-мер, для исследования наследственности человека используют метод родословных (генеалогический анализ), цитогенитиче-ский, популяционный, близнецовый и другие методы.

Развитие физико-химической биологии привело к разра-ботке метода генной инженерии, позволяющего конструировать молекулы ДНК с заданными свойствами. Этот метод основан на данных о свойствах ДНК и некоторых ферментов. Установлено, что ферменты эндоуклеазы могут «разрезать» (рестриктировать) замкнутые кольцевые молекулы ДНК на линейные сегменты. Эти ферменты были названы рсстриктазами. Их выделяют из микроорганизмов разных видов. Более того, рестриктазы разре-зают молекулы ДНК в строго определенных участках (сайты рестрикции, или узнавания), т.е. из одной молекулы ДНК можно получить линейные сегменты ДНК строго определенных размеров и в определенном количестве. Напротив, другие ферменты обладают по отношению к рестриктазам прямо противоположным действием. Такие ферменты лигируют (сшивают) в единые структуры сегменты ДНК, образованные рестриктазами. Ферменты с лигирующей способностью получили название л и г а з. Если «сшиваемые» сегменты происходят из разных ДНК, то лигазы формируют рекомбинантную молекулу ДНК.

Часто основой для создания рекомбинантных, гибридных, молекул  ДНК используют плазмиды, имеющие лишь один сайт рестрикции. Эти плазмиды выполняют роль так называемого генетического вектора, в который вводят тот или иной сегмент ДНК. Поскольку плазмида способна к размножению, то и ги-бридные молекулы ДНК, введенные в бактериальные клерки, тоже реплицируются. Это позволяет клонировать рекомбинант-ные молекулы ДНК в клетках. Таким образом, генетическая (генная) инженерия есть генетическое мани¬пулирование с целью создания рекомбинантных молекул ДНК.

Генетическая инженерия  сегодня — это получение новых  и реконструкция существующих генотипов (в широком смысле слова). Основу генетической инженерии составляет совокуп-ность различных экспериментальных приемов (методик). Они обеспечивают выделе¬ние нужного гена (сегмент ДНК) и объ-единение этого гена (клонируемый сегмент ДНК) с генетиче-ским вектором, например плазмидной ДНК. Разрезая исходные молекулы ДНК («сырье») на отдельные сегменты с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, получают индивидуальные ге-ны. ДНК-лигаза объединяет гены в новую совокупность. На ко-нечном этапе этого манипулирования рекомбинантные молеку-лы ДНК вводят в бактериальные клетки результате репликации вектора (размножение) происходит и репликация гибридных молекул ДНК при введении их в кишечную палочку или другой микроорганизм. Это и есть клонирование рекомбинантиых мо-лекул ДНК. Точнее, клонируя клетки, содержащие гибридные молекулы ДНК, клонируют, в сущности, и эти молекулы.

Генетическая инженерия  создала заделы на пути познания способов и путей «конструирования» новых  организмов или получения существующих организмов с заданными свойствами, что было мечтой многих поколений  биологов. Генетическая ин-женерия нашла широкое применение в изучении нормальной и патологической наследственности человека.

11. Строение и  функции нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты были обнаружены швейцарским биохимиком Ф. Мишером в ядрах клеток, содержащихся в гное, в 1868 году. Но уже в 1914 году доцент Петербургского универ-ситета А. Щепотьев предположил, что веществами, имеющими генетическое значение, являются, прежде всего, нуклеиновые кислоты. Однако мысль о генетическом значении нуклеиновых кислот в то время не получила распространения. Напротив, дли-тельное время, вплоть до начала 40-х годов, считали, что генный материал организмов — это белки или нуклеопротеиды. Генетическая специфичность нуклеопротеидов связывалась с их белковой частью, но не нуклеиново-кислотной.

В соответствии с современными взглядами, генетическим материалом, т.е. материалом, из которого состоят гены, является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), а у отдельных вирусов — рибонуклеиновая кислота (РНК). Будучи генетическим мате-риалом, нуклеиновые кислоты представляют собой носители генетической информации.

Эти взгляды основываются на ряде прямых и косвенных доказательств. К исторически самому первому  прямому доказа-тельству генетической роли ДНК относится установленная еще в 1944 году способность ДНК трансформировать пневмококки одного типа в другой. К настоящему времени трансформация показана у микроорганизмов многих видов. В дальнейшем пря-мые доказательства генетической специфичности ДНК были получены также в результате изучения размножения бактериальных вирусов (фагов).

Решающим прямым доказательством  в пользу генетиче-ской роли ДНК стала возможность конструирования рекомби-нантных молекул ДНК методом генной инженерии.

Что касается косвенных доказательств, то их существует несколько. Одно из первых сводится к тому, что локализация  ДНК в клетках специфична: ее обнаруживают в ядрах клеток, в частности  в хромосомах, в митохондриях и  хлоропластах. У многих микроорганизмов  ДНК локализована только в ядерной  области (нуклеоид) или в цитоплазме в виде плазмид. Для орга-низмов каждого вида характерно определенное количество  ДНК на клетку (табл.1).

Для организмов каждого вида характерно, что в диплоид-ных клетках ДНК содержится вдвое больше, чем в гаплоидных. Будучи посто¬янным у организмов всех видов, содержание ДНК в клетке не подвержено влиянию со стороны физиологических факторов, включая пол и старение, а также неблагоприятных воздействий, например, голодания, повышенных или понижен-ных температур.

К косвенным доказательствам  генетической специфично-сти ДНК могут быть отнесены также данные о способности ис-кусственно синтезированных аналогов пуриновых и пиримиди-новых оснований вызывать наследственные изменения клеток вследствие прямого включения этих аналогов в ДНК клеток. Наконец, косвенным Доказательством является и то, что мута-генный эффект УФ-излучения тесно связан со спектром погло-щения его молекулами ДНК.

Данные, которые приведены  в табл. 1, показывают, что со-держание ДНК в клетке зависит от того положения, которое за-нимают организмы на эволюционной лестнице, и повышается по мере их усложнения (вирусы – бактерии - грибы - беспозвоночные - позвоночные).

12. Химия и структура  ДНК

Нуклеиновые кислоты. Получили свое название от латинского nucleus - ядро, так как были найдены впервые как составная часть ядра. В 1868 г швейцарский врач, первооткрыватель ДНК Иоган Фридрих Мишер выделил из ядер лейкоцитов, полученных из гноя вещество, названное им нуклеином. Он провел элементарный химический анализ нуклеина из сперматозоидов лосося и установил его кислотные свойства. Термин «нуклеиновая кислота» был введен в 1899 г.

В ядрах присутствуют оба  типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК), а в  цитоплазме - в больших количествах РНК. ДНК обнаружена в пластидах и митохондриях дрожжей и высших организмов. Предполагают, что ДНК митохондрий и пластид ответственна за цитоплазматическую наследственность.

Нуклеиновые кислоты наряду с белками являются важнейшими биополимерами, образующими протоплазму живой клетки.

С химической точки зрения нуклеиновые кислоты (НК) — это  макромолекулярные соединения. Цепи НК построены по иному плану, чем  цепи белков, например, цепь нуклеиновой  кислоты однообразна. Она состоит из одних и тех же звеньев — нуклеотидов, представляющих собой соединение азотистого основания (пуринового или пиримидинового) с остатком сахара (рибозы или дезоксирибозы) и остатком фосфорной кислоты (рис.2,3).

Молекулы ДНК — это  линейные макромолекулы, представляющие собой длинные двойные цепи (тяжи) полимеров, составленных из мономеров, получивших название нуклеотидов и  являющихся строительными блоками  ДНК. У всех живых существ макромолекулы  ДНК построены по одному и тому же типу. Они слагаются в основном из одних и тех же нуклеотидов, каждый из которых содержит по одной  молекуле фосфорной кислоты и  сахара, а также одно из четырех  азотистых оснований — аденин, гуанин, цитозин или тимин.

Рис. 2.

Нуклеотиды ДНК построены  из четырех оснований: аденина (А), гуанина (Г), тимина (Т), цитозина (Ц) и сахара — дезоксирибозы, соединенных С—N-связью по первому углеродному атому дезоксирибозы. К пятому углеродному атому присоединен остаток фосфорной кислоты.

Рис.3.

Сахаром в ДНК является 2-D-дезоксирибоза — пятичленный  сахар (пентоза). К особенности данного  углевода относится то, что одна из его гидроксильных групп замещена на водород, т.е. этот сахар имеет  на один атом кислорода меньше, чем  обычная рибоза, поэтому его и  называют дезоксирибозой. Аденин и гуанин — пуриновые основания, тогда как цитозин и тимин — пиримидиновые. Сахарофосфат соединяется с азотистым основанием посредством B-гликозидной связи. Структура, образованная в результате соединения азотистого основания и сахара, носит название нуклеозида.

В РНК присутствуют те же звенья с заменой тимина на урацил (У) и дезоксирибозы на рибозу (рис.4).

Отдельные нуклеотиды, входящие в состав нуклеиновых кислот, соединяясь между собой через остаток фосфорной кислоты по третьему атому углерода, образуют длинную цепочку, длина которой в отдельных случаях может достигать 0,5 см.

Рис. 4

Разные нуклеотиды отличаются друг от друга природой сахаров и  оснований, которые входят в их состав. Будучи строительными блоками нуклеиновых  кислот, они в то же время могут  входить в состав некоторых важных коферментов, аккумулировать энергию  при дыхании или брожении и  образовывать соединения с макроэргическими связями.

При исследовании химического  состава ДНК Э. Чаргафф установил закономерность, получившую название «правил Чаргаффа». Во-первых, в молекуле любой ДНК количество молей аденина равно количеству молей nимина, а количество молей цитозина точно равно содержанию гуанина. Во-вторых, сумма пуриновых оснований в ДНК равна сумме пиримидиновых оснований. Правила Чаргаффа сыграли важную роль в расшифровке молекулярной структуры ДНК.

В 1953 г. Дж. Д. Уотсон и Ф. X. Крик опубликовали сообщение о своей модели ДНК в журнале «Natuге». ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, правозакрученных и свитых вместе относительно одной оси. Полный оборот спирали приходится на 10 пар оснований. Интересно, что цепи комплементарны друг другу, т. е. последовательность оснований в одной цепи: А, Т, Г, А, Г, Т и т. д. определяет последовательность их в другой: Т, А, Ц, Т, Ц, А и т. д. Степень полимеризации очень высокая, цепь может состоять из нескольких десятков (30—40) тысяч нуклеотидов (рис. 5). В отличие от ДНК рибонуклеиновая кислота одноцепочная, правозакрученная спираль (рис.6).

Нуклеиновые кислоты обоих  типов подобно белкам имеют первичную, вторичную и третичную структуры. В состав некоторых НК кроме нуклеотидов, содержащих обычные азотистые основания, в небольшом количестве входят нуклеотиды, содержащие минорные азотистые основания (метильные производные азотистых оснований) (рис. 7).

Главное химическое отличие между ДНК и РНК заключается в структуре сахара. Тот факт, что у рибозы есть лишняя ОН-группа, приводит к тому, что РНК легче подвергается действию окислителей, чем ДНК, т. е. менее устойчива. ДНК нерастворима в условиях клетки (рН 7). Под влиянием нагревания, изменения рН может «расплетаться», превращаясь в две отдельные полинуклеотидные цепочки. Эти процессы — денатурация и рекомбинация ДНК — постоянно происходят в клетке под действием специальных ферментов — нуклеаз и играют важнейшую роль при делении живой клетки и синтезе белков. ДНК в ядрах находится в комплексе с белками (в основном гистонами) в виде нуклеопротеида, где НК связаны водородными и солевыми связями с белками.