Шпаргалка по "Генетика"

Основная функция ДНК  — хранение и передача наследственной информации. Именно ДНК используется в генной инженерии для создания новых видов организмов.

Рис. 5

РНК подразделяются на три  основных типа: информациоиную, или матричную (м-РНК), транспортную (т-РНК) и рибосомальную (р-РНК). Все три типа РНК синтезируются непосредственно на ДНК, которая служит матрицей для этого процесса. Количество РНК в каждой клетке прямо пропорционально количеству вырабатываемого этой клеткой белка.

Матричная РНК составляет 3—5 % всей содержащейся в клетке РНК. Она обладает повышенной метаболической активностью, непрерывно распадается и синтезируется вновь в бактериальной клетке. Синтез м-РНК идет на одной из цепей молекулы ДНК (транскрипция), при этом механизм (т. е. на какой конкретно цепи будет считываться информация, закодированная в последовательности нуклеотидов) пока до конца не выяснен. Длина цепи зависит от длины ДНК. Молекулярная масса м- РНК больше молекулярной массы р-РНК.

Рибосомная РНК входит в состав рибосом. Это высокомолекулярная РНК, нерастворимая в условиях клетки. Она составляет более 80 % всей РНК клетки. р-РНК кодируется особыми генами, находящимися в нескольких хромосомах и расположенных в ядрышке. Последовательность оснований в р-РНК идентична для всех организмов — от бактерий до высших растений и животных. р-РНК содержится в цитоплазме, образуя вместе с белковыми молекулами рибосомы (рис.6).

Транспортная РНК составляет около 15% всей клеточной РНК. Это растворимая в условиях клетки низкомолекулярная РНК (в нее входит в среднем 80 нуклеотидов). т-РНК доставляет активированные аминокислоты к месту синтеза белка, играя роль связующих звеньев между триплетным кодом, содержащимся в м-РНК, и аминокислотной последовательностью полипептидной цепи. Каждая переносимая аминокислота имеет свою т-РНК. Вторичная и третичная структуры этой т-РНК весьма изменчивы и отличаются от матричной и рибосомной РНК.

В процессе синтеза белка  антикодон определяет, какая аминокислота должна присоединиться к синтезируемой полипептидной цепи, узнавая свой триплет (кодон), находящийся в данный момент в рибосоме. Как только аминокислота займет свое место, рибосома переместится по нити м-РНК, чтобы новый кодон занял в ней место предыдущего. Следующая аминокислота, благодаря антикодону т-РНК, переносящей ее, узнает свое место и т.д. Поскольку одна аминокислота может кодироваться несколькими триплетами (кодонами), число т-РНК превышает количество аминокислот, входящих в состав белков, т. е. 20. В настоящее время обнаружено 60 т-РНК, участвующих в синтезе белковых молекул.

Итак, чтобы поддерживать жизнь, клетке необходимо иметь: вещество, из которого она строит собственные органеллы; энергию, чтобы это вещество использовать, и информацию, позволяющую воспроизводить себе подобных. Вещество и энергия поступают с белками, сохранение и передачу информации осуществляют нуклеиновые кислоты.

Рис. 6

 

 

 

 

 

 

13-14-15

Учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Основные этапы решения  генноинженерной задачи следующие:

1. Получение изолированного  гена.

2. Введение гена в вектор  для переноса в организм.

3. Перенос вектора с  геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток  организма.

5. Отбор генетически модифицированных  организмов (ГМО) и устранение  тех, которые не были успешно  модифицированы.

Процесс синтеза генов  в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают  программы синтеза различных  нуклеотидных последовательностей. Такой  аппарат синтезирует отрезки  ДНК длиной до 100—120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию. Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты — олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице выделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага, в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.

Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит также были удостоены Нобелевской премии (1978 г.).

Техника введения генов в  бактерии была разработана после  того, как Фредерик Гриффит открыл явление бактериальной трансформации. В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами. Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.

Значительные трудности  были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе  наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и  с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности  внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического  материала в клетку. Такой процесс  получил название трансфекция.

Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или  культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, то есть отбор тех организмов и  их потомков (клонов), которые подверглись  модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.

 

16. Методы получения трансгенных растений

Трансгенные растения — это те растения, которым «пересажены» гены других организмов.

Картофель, устойчивый к  колорадскому жуку, был создан путём  введения гена выделенного из генома почвенной тюрингской бациллы Bacillus thuringiensis, вырабатывающий белок Cry, представляющий собой протоксин, в кишечнике насекомых этот белок растворяется и активируется до истинного токсина, губительно действующего на личинок и имаго насекомых, у человека и других теплокровных животных подобная трансформация протоксина невозможна и соответственно этот белок для человека не токсичен и безопасен. Опрыскивание спорами Bacillus thuringiensis использовалось для защиты растений и до получения первого трансгенного растения, но с низкой эффективностью, продукция эндотоксина внутри тканей растения существенно повысило эффективность защиты, а также повысило экономическую эффективность ввиду того, что растение само начало продуцировать защитный белок. Путём трансформации растения картофеля при помощи Agrobacterium tumefaciens были получены растения, синтезирующие этот белок в мезофилле листа и других тканях растения и соответственно непоражаемые колорадским жуком. Данный подход используется и для создания других сельскохозяйственных растений, резистентных к различным видам насекомых.

Создать геноизмененное растение на данном этапе развития науки для генных инженеров не составляет большого труда.

Существует несколько  достаточно широко распространенных методов  для внедрения чужеродной ДНК  в геном растения. Ниже, не зацикливаясь на подробностях, мы постарались их изложить.

Метод 1:

Существует бактерия Agrobacterium tumefaciens (Лат.- полевая бактерия, вызывающая опухоли), которая обладает способностью встраивать участки своей ДНК в растения, после чего пораженные клетки растения начинают очень быстро делиться и образуется опухоль. Сначала ученые получили штамм этой бактерии, не вызывающий опухолей, но не лишенный возможности вносить свою ДНК в клетку. В дальнейшем нужный ген сначала клонировали в Agrobacterium tumefaciens и затем заражали уже этой бактерией растение. После чего инфецированые клетки растения приобретали нужные свойства, а вырастить целое растение из одной его клетки сейчас не проблема.

 

Метод 2:

Клетки, предварительно обработанные специальными реагентами, разрушающими толстую клеточную оболочку, помещают в раствор, содержащий: ДНК и вещества, способствующие ее проникновению в  клетку. После чего как и в первом случае выращивали из одной клетки целое растение.

 

Метод 3:

Существует метод бомбардировки  растительных клеток специальными, очень  маленькими вольфрамовыми пулями, содержащими  ДНК. С некоторой вероятностью такая  пуля может правильно передать генетический материал клетке и так растение получает новые свойства. А сама пуля ввиду  ее микроскопических размеров не мешает нормальному развитию клетки.

17. Методы получения  трансгенных животных

Если вводить ДНК в  клетки многоклеточного организма, то результатом трансформации будет  изменение свойств лишь небольшого числа клеток, которые приобрели  новый ген или гены. Следовательно, для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые перенесут новые свойства потомкам. У растений и животных целесообразно изменять такие свойства, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям, способность адаптироваться к новым внешним условиям. В качестве маркеров в этом случае можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (AFLP), анализ мини-сателлитов, анализ микросателлитной ДНК (SSR), гибридизацию и т.д.

Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых  растений. От работы с довольно крупными яйцами амфибий перешли к изучению яйцеклеток и эмбрионов мыши, которая  представляет наиболее изученное в  генетическом отношении млекопитающее.

Микроинъекцию клонированных генов производят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Можно вводить ген в  сперматозоиды и затем проводить  ими оплодотворение. Таким образом  были инъецированы гены интерферона  и инсулина человека, ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер - от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10 - 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

Интеграция чужеродных генов  неспецифична по отношению к хромосомам, а число копий чужеродного  гена может различаться от нескольких штук до 100 и более. Эти гены образуют группу тандемных повторов, объединенных по типу "голова к хвосту". Чужеродная ДНК после инъекции была обнаружена как в соматических, так и в  половых клетках. Это означает, что  интеграция проходит на самых ранних стадиях развития зиготы.

В нескольких случаях гетерологичная ДНК наследовалась в трех поколениях мышей, что свидетельствует о стабильной интеграции. Интегрировавшая в половые клетки ДНК передается как менделевский ген. Установлено, что уровень экспрессии чужеродного гена зависит от места интеграции ДНК с хромосомами и от степени ее метилирования, а также от дифференцировки тканей. В некоторых случаях удалось получить тканеспецифическую экспрессию. Важно отметить что специфические чужеродные гены можно встраивать в геном клетки таким образом, что они подчиняются нормальным регуляторным сигналам.

В 1981 году Константини и Лэси (Оксфорд) провели инъекцию в яйцеклетки мыши фрагменты хромосомной ДНК кролика длиной 19 килобаз. Эти фрагменты содержали ген β-глобина кролика. Яйцеклетки культивировали до стадии бластоцисты и имплантировали в матку. У 24 мышей, родившихся в результате развития имплантированных яйцеклеток, проведены частичная гепатоэктомия. Анализ ДНК из клеток печени показал, что у 9 мышей встречается от 1 до 20 копий на клетку гена β-глобина. После спаривания 4 трансформированных самцов с нормальными самками получили потомство из 18 животных. 6 из них также имели ген β-глобина. Установлено, что интеграция гена в клетки млекопитающих происходит случайным образом и не связана с конкретными областями хромосомы. Ген нестабилен, может быть утрачен или стать неактивным. Вместе с геном необходимо вводить регуляторные последовательности.

Метод введения генов в  эмбриональные клетки имеет ограничения. Не всегда удается встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы. Разработанные методические примы  пока не позволяют заменить имеющийся  в геноме ген, вытесняя его, не всегда удается подчинить новый ген  системе регуляции организма.

При трансгенозе могут возникать неожиданные проблемы. Например, одни из первых работ по генетической транформации животных проводились путем встраивания генов гормона роста. Перенос гена гормона роста крысы мышам увеличивал рост мышей в 2 раза. Эксперименты по трансгенозу генов гормона роста быка кроликам также увенчались успехом. А вот аналогичные эксперименты по модификации крупного рогатого скота привели к увеличению прироста всего на 10-20%. Очевидно, это связанно с тем, что у мышей сохраняется широкая норма реакции, и встраивание генов, увеличивающих количество гормона, заставляет генотип реализоваться максимально полно. У домашнего скота в результате направленной селекции организмы работают на верхнем пределе нормы реакции, отсюда ожидаемый эффект не проявился.

В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена веществ сказалось на содержании жира. У таких животных ингибировались процессы липогенеза и активировался синтез белка. К изменению обмена веществ приводило и встраивание генов инсулиноподобного фактора. Такие трансгенные свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной системы.