Бактеріоцини

">     3.1. Визначення особливостей росту P. aeruginosa РАЕ – 22 при різних температурах.

     Визначення  особливостей росту штама-продуцента проводили з метою оцінки оптимальних  умов його інкубування. Було показано, що титр мікроорганізмів в 16, 18, 20, та 22-х годинних культурах був приблизно однаковий, в межах статистичної похибки (табл.. 3.1.).

     Таблиця 3.1.

     Титр штама-продуцента в добовій культурі.

 

     Виходячи  із наведеного в подальшій роботі використовували 18-20 годинну культуру, яка характеризується найбільш типовим значенням титру мікроорганізмів.

     За  культивування при 37°С титр мікроорганізмів після внесення і до 2-х годин спостереження частково знижувався. Після цього спостерігали інтенсивне розмноження із досягненням стаціонарної фази на 5-6 годину інкубування. Час подвоєння штама-продуцента становив 66 хвилин.

Рис. 3.1. Крива росту P. aeruginosa РАЕ - 22 при 37°С

     При 28°С вплив температурного фактора  був менш вираженим, оскільки в перші  дві години інкубування падіння  титру не виявилось. В даному випадку  було відмічено часткове наростання кількості мікроорганізмів. Досягнення стаціонарної фази росту виявилося на 7-8 годину інкубування. Подовження даного періоду пов’язано із більш інтенсивним вихідним розведенням бактеріальної суспензії, яка в даному випадку становить 1:50. Час подвоєння кількості мікроорганізмів штама-продуцента в даному випадку становив 55 хвилин.

     Аналогічно  як і при 28°С, при 20°С зниження титру  мікроорганізмів на перших годинах  інкубування не спостерігалось. Було характерним поступове наростання їх кількості, час подвоєння мікроорганізмів  при цьому становив 77 хвилин.

     Виходячи  із отриманих результатів було зроблено висновок, що для даного штама-продуцента найбільш оптимальною температурою інкубування є 28°С. Саме при зазначеному температурному режиму очевидно слід продовжувати їх інкубування в подальшому.

Рис. 3.2. Крива росту P. аeruginosa РАЕ - 22 при 28°С 
 
 

Рис. 3.3. Крива росту P. aeruginosa РАЕ - 22 при 20°С

     3.2. Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання індуктора різної концентрації.

     На  первинному етапі оптимізації індукції визначали концентрацію індуктора  необхідного для отримання максимально  активних лізатів. З цією метою використовували  налідиксову кислоту, яку вносили  до кінцевих концентрацій 10 мкг/мл, 100 мкг/мл і 500 мкг/мл (таблиця 3.2.). Одночасно визначали  також рівень спонтанної індукції бактеріоцинів, за умови, коли індуктор не вносився. Активність бактеріоцинів при спонтанному виділені на індикаторі УКМ P. аeruginosa В-3 становила 8 Од., а на УКМ P. аeruginosa В-10 – 256 Од. Використання налідиксової кислоти у концентрації 10 мкг/мл суттєво не підвищувало рівень індукції, про що свідчить однакова активність лізатів на обох індикаторних культурах. Додавання індуктора у максимальній концентрації 500 мкг/мл підвищувала активність речовин у 8 разів. Так, на індукторному штамі УКМ P. Аeruginosa В-3 спостерігається наростання із 8 Од. до 64 Од, а на УКМ P. Аeruginosa В-10 – із 128 Од до 1024 Од. Максимально виражений індукуючий вплив було відмічено при внесенні налідиксової кислоти в концентрації 100 мкг/мл. В даному випадку активність на УКМ P. Аeruginosa В-3 зростала в 16 разів, а на УКМ P. Аeruginosa В-10 – лише в 2 рази.

     Аналізуючи  отримані результати потрібно відмітити, що оптимальним використанням індуктора  є внесення налідиксової кислоти  до кінцевої концентрації 100 мкг/мл. В  окремих випадках застосування концентрації 500 мкг\мл спричиняє до виділення  вдвічі активніших лізатів, проте застосування для цього п’ятикратної концентрації індуктора є невиправданим. Виходячи із наведеного в подальшому використовували налідиксову кислоту в концентрації 100 мкг/мл.

 

     Таблиця 3.2.

     Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів  P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання індуктора різної концентрації.

Примітка. Тут і далі: С мкг/мл – кінцева концентрація налідиксової кислоти в розчині; Л – ефективність лізису; К – характер країв зони лізису; А – кратність розведення вихідного лізату; d – діаметр зони затримки росту; «—» - відсутність активності.

 

     3.3. Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом інкубування бактеріальної суспензії при різних температурах.

     Наступним етапом дослідження було визначення оптимальної температури для індукції бактеріоцинів у максимальних кількостях.

Таблиця 3.3.

     Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів  P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом інкубування бактеріальної суспензії при різних температурах.

Примітка: t °С – температура інкубування культури. 

     Відмічено, що оптимальною температурою для індукції виділення бактеріоцинів є 28°С. На індикаторній культурі УКМ P. Аeruginosa В-10 максимальна активність становила 1024 Од. На індикаторній культурі УКМ P. aeruginosa B-3 максимальна активність спостерігалась при 20 та 28°С і становила 512 одиниць. Лізати отримані при 37°С проявили досить високу активність, хоча й нижчу на декілька порядків від описаних раніше. Дещо нижчою активністю характеризуються лізати, отримані при 37°С. При цьому на індикаторному штамі УКМ P. Аeruginosa В-3 дана відмінність є більш суттєвою. 

     3.4. Оптимізація індукції з метою  отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання культури продуцента на різних фазах росту.

     Наступним етапом дослідження була перевірка  активності лізатів, отриманих шляхом використання культури штама-продуцента на різних стадіях росту. З цією метою  добову культуру підрощували протягом 2-5 годин при 28°С і 37°С, після чого вносили індуктор. При цьому титр мікроорганізмів на 2 годину становив 1,6 х 10⁸ КУО/мл при 28°С та 2,3 х 10⁸ КУО/мл при 37°С, на 3 годину 3,75 х 10⁸ КУО/мл при 37°С, на 4 годину 4,95 х10⁸  КУО/мл при 28°С, на 5 годину 6 х 10⁸ КУО/мл при 28°С та 1,95 х 10⁹ КУО/мл при 37°С.

     Було  показано, що активність лізатів при  культивуванні за 37°С (таблиця 3.4.) була нижчою ніж при 28°С (таблиця 3.5.) На індукторній  культурі УКМ P. аeruginosa В-3 активність лізатів відрощуваних протягом 3 годин при 37°С  становила 128 Од, а на культурі УКМ P. Аeruginosa В-10 1024 Од. при 5 годинах підрощування.

 

     Таблиця 3.4.

     Оптимізація індукції бактеріоцинів P. аeruginosa РАЕ – 22 внаслідок внесення культури продуцента на різних фазах росту та інкубування при 37°С.

     Примітка: Т – час підрощування культури. 

     Більш однозначними були результати активності лізатів, отриманих при 28 °С. Так, на обох індикаторних штамах максимальною була активність після підрощування протягом 4 годин. На індикаторній культурі УКМ P. Аeruginosa В-3 активність зазначених речовин становила 1024 Од, а на УКМ P. Аeruginosa В-10 – 4096. Виходячи із наведених результатів було зроблено висновок, що оптимальними умовами для отримання бактеріоцинів є підрощування протягом 4 годин при 28°С. В даний період культура знаходиться в експоненційній фазі росту, що очевидно, має суттєве значення для оптимізації індукції з метою підвищення кілерної активності лізатів.

 

Таблиця 3.5.

     Оптимізація індукції бактеріоцинів P. аeruginosa РАЕ – 22 внаслідок внесення культури продуцента на різних фазах росту та інкубування при 28°С.