Бактеріоцини

     При синтезі бактеріоцинів також  синтезується білок імунності, який здатний взаємодіяти з бактеріоцином  і інактивувати його. Використовуючи методи конструювання гібридних  білків було доведено, що С-термінальний поро-утворюючий домен бактеріоцинів  проявляв чутливість до імунного білку  даних речовин. Виходячи з цього  було зроблено висновок, що імунні білки  поро-утворюючих бактеріоцинів взаємодіють  з поро-утворюючим доменом відповідного бактеріоцину та інактивують його, що запобігає процесу ліричного  впливу на клітину.

     Секретовані бактеріоцини звільняються після експресії  генів, що кодують бактеріоцин-звільнюючий  білок, який викликає лізис клітин. Дана речовина носить назву лізуючий або кілерний білок. Ці білки виділяються  у цитоплазмі в розчиненому стані  до вивільнення бактеріоцинів. Найбільш вивченими з кілерних білків є  коліцини, які разом з бактеріоцинзвільнюючим білком кодуються в генах плазміди ColDF13. Дані речовини схожі за багатьма властивостями до білків інших бактеріоцинів  включаючи їх генетичну організацію, особливості транскрипції, синтезу, та виділення.

     Характерний для бактеріоцинів кілерний процес є кінетичним явищем. Дослідження  кілерного впливу на чутливі клітини  бактеріоцинів проводили також  за допомогою електронної мікроскопії. Показано, що механізм їх впливу пов'язаний як з морфологічними змінами в  самих бактеріоцинах так і  в  чутливих клітинах.

       В дослідженнях було показано, що бактеріоцини грам-позитивних  бактерій відносяться до низькомолекулярних  сполук. Морфологічні зміни, які  спричинюють дані були пов’язані  з втратою рибосом, концентрування  нуклеїнових матеріалів, модифікацією  мезосом. Високомолекулярні бактеріоцини  грам-негативних бактерій це високомолекулярні  структури, що візуалізуються  електронній мікроскопії. Дослідження  показали, що ці частинки зв’язувалися  із чутливими клітинами за  допомогою  базальних пластинок.  При цьому спостерігається загальне  руйнування клітини мішені. Встановлено,  що внаслідок дії цих частинок  бактеріальні клітини гинули  на 90% від загальної кількості  проаналізованих [1].

      1.4. Генетичні особливості бактеріоцинів родини Pseudomonas.

     Дослідження піоцинів показало наявність структур, схожих на фагових хвостових відростків, які були класифіковані як піоцини R та F типу. Були спроби знайти фаги, які  могли бути попередниками даних  піоцинів. В результаті ряду досліджень ізольовано певні фаги, які позначили  як R та F споріднені. Ця спорідненість  виявлялася у здатності антисироватки, проти піоцинів, нейтралізувати також  і ізольовані фаги. Так, наприклад, фаги PS3 і PS17 нейтралізувалися анти-R-сироваткою, а фаг KF1-нейтралізувався анти-F-сироваткою. Було доведено, що можливий обмін компонентами R піоцином та фагом PS17, відомий як фенотиповий  міксинг. Безголові мутанти фагу PS17 із відсутньою голівкою проявляли  вплив на чутливі клітини, схожий з впливом R піоцинів. Окрім даних  фагів також було ізольовано цитотоксин-конвертуючий фаг, який також виявляв спорідненість  до R піоцинів [3].

     В ході ряду генетичних досліджень та сиквенування геному Pseudomonas aeruginosa на бактеріальній хромосомі було виявлено кластер генів в якому було закодовано структурні гени та гени активації бактеріоцинів. Дані гени розташовуються на відрізку між генами trpE та trpGCD, і поділені на п’ять кластерів: I – гени регулятори експресії, II – гени невідомої функції, III – гени, що відповідають за функцію лізису, IV - структурні гени R піоцинів, V – структурні гени F піоцинів [3].

     Структурні  гени піоцинів F типу локалізовані між  кластером генів R піоцинів та trpGCD. Для піоцинів R типу в свою чергу було ідентифіковано 14 генів – trpA-N та trpR, які розміщені на фрагменті розміром 13kb між генами trpE та trpGCD. Гени prtR та prtN виступали регуляторами експресії генів піоцинів. Білок гена prtN розглядається як транскрипційний активатор для всіх типів піоцинів. Сайтом зв’язування для цього є структура, названа P-box. Білок РrtR репресує ген prtN, та інактивується за наявності активованого RecA. УФ-випромінювання або дія мітоміцину С, які розглядаються як класичні індуктори бактеріоцинів, запускає експресію генів піоцинів. Гени, що кодують функціональні білки є еволюційно консервативними.

     При дослідженнях із використанням мутантних  штамів P. aeruginosa, які втратили здатність до утворення піоцинів R типу. Було виявлено відрізки генів, які відповідали приблизно двом рамкам зчитування, і могли бути регуляторними відрізки експресії генів піоцинів. Механізм, за яким функціонують дані послідовності схожих за функцією P-box. Можливо дані структури є сайтами зв’язування для транскрипційного активатора prtN.

     Гени, які містять R-піоцин специфічну ділянку  характеризуються високою гомологією з генами, хвостів фагів родини Р2, як Р2, 186 та φСТХ. З 16 рамок зчитування 12 виявилися високогомологічними  до генів Р2 та φСТХ. В багатьох подвійно-закручених спіралей ДНК фагів родини Р2 N-термінальний кінець білку хвоста відповідає за зв’язування із базальними пластинками, а С-кінець за з’єднання з рецепторами  клітини мішені. Відповідно, до описаного  гену, в яких закодовані інші піоцини F-типу, виявилися високогомологічними  до генів, кодуючих хвости фагів родини λ.

     В результаті даних досліджень було зроблено висновки, що базальні пластинки фагів  Р2, φСТХ та піоцинів R типу є близькоспорідненими,  рецептори для піоцинів R типу та фагів містять оліго- та ліпополісахариди, а сайти зв’язування в ліпополісахаридному  шарі P. aeruginosa для φСТХ та R піоцинів відрізняються [3].

      Розділ 1.5. Піоцини

     Бактеріоцини  – білкові молекули, які містять  у своєму складі також вуглеводи (1%) та фосфор (0,1%) [1].

     В давніших роботах по дослідженню  коліцинів було виявлено структури  різного складу. Одні з них були ліпополісахаридними білковими  комплексами асоційованими з  О-соматичним антигеном, такий як К-К 235, і враховуючи його структуру активність була пов`язана з карбоксильною  частиною. В той час як інший  містив мало, або зовсім не містив, вуглеводів – Е2-Е9, з молекулярною масою близько 60 кДа. Інші, схожі на коліцин Е2, були також досліджені і містили низький  рівень вуглеводів(>10%).

     Одним із досліджених бактеріоцинів є  бактеріоцини родини Pseudomonas – піоцини, які поділяються на три типи: R, F та S-тип.

     Піоцини R-типу є білковими частками вільними від вуглеводних залишків і нуклеїнових  кислот. Далі піоцини нагадують негнучкі та скорочувальні схожі з хвостами бактеріофагів. Дані піоцини були розділені  на п`ять груп: R1, R2, R3, R4 та R5, які схожі  за своєю будовою та серологічними  властивостями, але відрізняються  за специфічністю рецептора до якого  відбувається приєднання. Механізм їх дії пов'язаний з деполяризацією цитоплазматичної мембрани та інгібуванням активного транспорту в клітині  мішені.

     Піоцини F типу також мають будову схожу  з хвостами бактеріофагів, але на відміну від R, гнучку та не скорочувальну. На сьогоднішній день піоцини F типу поділяються  на три групи: F1,F2 та F3. Дані піоцини  мають схожу структуру та серологічні  властивості, але відрізняються  за специфічністю рецептора.

     Піоцини S типу, отримані при індукції мітоміцином  С, відрізняються від попередніх швидкістю дифузії через агар, чутливістю до протеаз. Поділяються  на: S1, S2, S3  та AP41. Між собою відрізняються  різним кілерним спектром, в усіх випадках проявляється ДНКазна активність.

     Всі бактеріоцини є гетерогенними структурами  від низькомолекулярних до високомолекулярних часток з комплексною структурою, але кілерна активність повязана виключно білковою в частиною[1].

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

     РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

     2.1. Використані поживні середовища  і культури мікроорганізмів

     Для культивування мікроорганізмів  в рідкому середовищі використовували  МПБ, перевірку кілерної активності проводили на чашках із щільним середовищем  МПА, поверх якого наносили індикаторні культури у складі напіврідкого 0,7% - ного агару.

     Одержання бактеріоцинів здійснювали із Pseudomonas aeruginosa РАЕ - 22 отриманого із УКМ (Української колекції мікроорганізмів, Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України).

     Як  індикаторні культури застосовували  штами P. aeruginosa УКМ В-3 і УКМ В-10. 

     2.2. Оцінка особливостей росту P. aeruginosa РАЕ - 22 при різних температурах.

     Суспензію штама – продуцента із добової  культури відбирали на 16,18, 20 та 22 годину росту. В подальшому проводили розведення бактеріальної суспензії в МПБ у співвідношенні 1:20 (по об’єму). Інкубування проводили при 20, 28, 37°С на качалці (240 об/хв.) протягом 6-8 годин. Кожну годину із суспензії відбирали матеріал і визначали титр мікроорганізмів. За отриманими результатами будували криві росту мікроорганізмів і визначали час подвоєння. 

     2.3. Оптимізація індукції з метою  отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання індуктора різної концентрації.

     Для отримання бактеріоцинів добову культуру штама-продуцента розводили  з МПБ у співвідношенні 1:20 (по об’єму) і підрощували на качалці (240 об/хв.) при 37°С протягом 3-х годин. У якості індуктора було використано  налідиксову кислоту, яку вносили до кінцевих концентрацій 10, 100 та 500 мкг/мл. В подальшому суспензія додатково інкубувалась 3 год., за вказаних вище умов. Наступним етапом було внесення в суспензію хлороформу у співвідношенні 1:50 (по об’єму) та повторне інкубування на протязі 3-х год. за описаних вище умов. Очистку отриманих лізатів проводили шляхом низько швидкісного центрифугування при 6000 тис. об/хв., протягом 30 хв. Отримані супернатанти асептично відбирали і зберігали в закритих ємкостях при 4-6°С. У якості консерванту використовували хлороформ. 

     2.4. Оптимізація індукції з метою  отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом інкубування бактеріальної суспензії при різних температурах.

     Для отримання бактеріоцинів добову культуру штама-продуцента розводили  з МПБ у співвідношенні 1:20 (по об’єму) і підрощували на качалці (240 об/хв) при 20, 28 та 37°С протягом 3-х  годин. У якості індуктора було використано  налідиксову кислоту, яку вносили до кінцевої концентрації 100 мкг/мл. В подальшому суспензія додатково інкубувалась 3 год., за вказаних вище умов. Наступним етапом було внесення в суспензію хлороформу у співвідношенні 1:20 (по об’єму) та повторне інкубування на протязі 3-х год. за описаних вище умов. Очистку отриманих лізатів проводили шляхом низько швидкісного центрифугування при 6000 тис.об/хв., протягом 30 хв. Отримані супернатанти асептично відбирали і зберігали в закритих ємкостях при 4-6°С. У якості консерванту використовували хлороформ. 

     2.5 Оптимізація індукції з метою отримання бактеріоцинів P. aeruginosa РАЕ – 22 у максимальних концентраціях шляхом використання культури продуцента на різних фазах росту.

     Для отримання бактеріоцинів добову культуру штама-продуцента розводили  з МПБ у співвідношенні 1:20 (по об’єму) і підрощували на качалці (240 об/хв) при 37°С протягом 2, 3, 4, та 5-ти годин. У якості індуктора було використано  налідиксову кислоту, яку вносили до кінцевої концентрації 100 мкг/мл. В подальшому суспензія додатково інкубувалась 3 години, за вказаних вище умов. Наступним етапом було внесення в суспензію хлороформу у співвідношенні 1:20 (по об’єму) та повторне інкубування протяом 3-х год. за описаних вище умов. Очистку отриманих лізатів проводили шляхом низько швидкісного центрифугування при 6000 тис.об/хв., протягом 30 хв. Отримані супернатанти зберігали в закритих ємкостях при 4-6°С. У якості консерванту використовували хлороформ. 

     2.6. Визначення кілерної активності отриманих лізатів

     Кілерну активність перевіряли методом «двошарового агару». З цією метою розплавлений і охолоджений до 50-55° С напіврідкий (0,7% - ний) агар вносили підрощену добову культуру індикаторного штаму і нашаровували на МПА в чашці Петрі. Після застигання верхнього агару на газон індикаторної культури наносили отримані лізати об’ємом 5 мкл. Чашки інкубували протягом 18-24 год. при 28° С. Утворення на газоні з індикаторною культурою негативних зон затримки росту вказувало на наявність в досліджуваних лізатах речовин із кілерними властивостями стосовно використаного індикаторного штаму.

     Кількісні параметри активності відповідних  лізатів визначали шляхом подвійних серійних розведень до 1:4096. Аліквоти кожного із розведень наносили на газон і визначали найбільше розведення, при якому спостерігалась поява негативних зон лізису. Дане розведення приймали за активність досліджуваної речовини. 

     РЕЗУЛЬТАТИ

     Відомо, що мікроорганізми здатні виділяти бактеріоцини, які впливають на філогенетично  споріднені штами. Раніше нами було показано, що P. аeruginosa РАЕ – 22 є продуцентом високоактивних бактеріоциноподібних речовин. Тому, метою нашої роботи було оптимізація індукції з метою отримання зазначених речовин у максимальних концентраціях. Перевірку активності проводили на індикаторних культурах P. aeruginosa В-3 та В-10.