Криоконсервация. Банки гибридом. Применение моноклональных антител

    Соломинки и пробирки в свою очередь помещаются в специальные кассеты в горизонтальном положении, кассеты загружаются в охладители или аппаратуру для хранения с постоянно поддерживаемой темепратурой. При криоконсервации до -196 град С используется среда хранения – жидкий азот. Замороженные культуры клеток можно извлекать из среды хранения без вреда лишь на очень ограниченное время – не более 1-2 мин. При постоянно поддерживаемой температуре хранения культуры клеток могут храниться десятки лет (например, сперма – 10 лет).

    Оборудование:

1. Программные охладители - замораживатель программный KRYO 360-1.7, KRYO 560-16 (последние цифры обозначают объём рабочей части), система криоконсервации Kryosave Intregra полнофункциональная 30 л (фирма «PLANER»), CL2200 SYS, CL3300 (фирма «CRYOLOGIC»), КОП-6  и др. (используются для витрификации);
2. Насосы для жидкого азота - насос для жидкого азота активный для лабораторного дьюара 30 л и др.;
3. Дополнительные принадлежности для замораживателей различных объёмов – холдеры на 3-5 соломин объёмом 0,25-0,5 мл, микроаспираторы для соломин, вакуумный мининасос для заполнения соломин, сменные наконечники (фирма «CryoBioSystem»);
4. Оборудование медицинское для хранения крови, клеток и тканей в жидком азоте – марок V-1500B, S-1500B, S-3000B, V-3000B, V-5000BEH  фирмы «Дельрус»;
5. Дьюары – сосуды для хранения и транспортировки жидкого азота, марок: дьюар лабораторный MVLAB30, дьюар низкого давления, 230 л.   

    3.Банки  гибридом.

    3.1.Что  такое гибридомы.

    Гибридома (от гибрид и греч. -oma - опухоль) - клеточный гибрид, получаемый слиянием нормальной клетки (например, иммунного лимфоцита) с опухолевой. Обладает способностью к синтезу специфического белка, например, антитела (свойство нормальной клетки), и к неограниченному росту (свойство опухолевой клетки). Синтезируемые гибридомой моноклональные антитела применяют во многих областях биологии и медицины. Ведутся работы по получению гибридом, продуцирующих другие белки - факторы свертывания крови, гормоны и т. п.

    Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Они созданы на основе клонально-селекционной теории иммунитета и явились самым ярким и окончательным доказательством этой теории. Гибридомы сделали реальностью предполагаемые клоны антителообразующих клеток и позволили даже обнаружить их существование в организме до введения соответствующего антигена. Гибридомы революционизировали иммунологическую промышленность и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей.

    Хотя гибридомы скорее относятся к гениальным изобретениям, а не к открытиям, они были отмечены в 1984 году Нобелевской премией, высшей научной наградой, присуждаемой за выдающиеся открытия. 
Если бы Кёлер и Мильштейн запатентовали свой метод, они вскоре бы стали миллиардерами, так как все, кто использовал бы гибридомы в коммерческих целях, должны были бы платить за право пользоваться патентом. Авторы гибридом, несомненно, понимали это, но в интересах развития науки не пошли на такой шаг. Метод гибридом беспрепятственно вошел во все сферы иммунологии, и сами авторы всемерно способствовали этому, предоставляя свою клеточную линию плазмоцитомы для исследований всем желающим. И первые гибридомы в нашей стране, полученные в 1979-1980 годах, были созданы на основе клеток, ведущих происхождение из лаборатории этих авторов и с их любезного разрешения.

    3.2.Создание  гибридом.

    В 1975 году была описана методика, позволяющая  получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител (моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью. Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная технология" является одним из основных направлений в биотехнологии.

    Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующие антитела одной специфичности. Гибридомы получают при слиянии  нормальных лимфоцитов, продуцирующих антитела, с подходящей опухолевой линией B- клеток. Затем гибридомы отбирают в культуральной среде, неспособной поддерживать рост родительских клеток (среда ГАТ). Путем последовательных разведений и пересевов получают одиночные клоны, которые можно выращивать в роллерных культурах или в форме асцита в брюшной полости мышей. В последнем случае удается получать особенно высокие титры моноклональных антител. При этом, естественно, все молекулы иммуноглобулинов, продуцируемые определенной гибридомой, идентичны: они относятся к одному классу и одному аллотипу, имеют одинаковые вариабельные области, структуру, идиотип, аффинность и специфичность к данному эпитопу.

    Для получения гибридом применяются клетки миеломы - линии клеток, производящих моноклональные антитела определенной специфичности. Поскольку эти клетки осуществляют эффективную секрецию рекомбинантных белков, они хорошо изучены в отношении экспрессии в них соответствующих рекомбинантных генов, введенных с помощью трансфекции.  
 

Здесь представлена общая схема получения моноклональных антител методом гибридомной технологии. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    3.3.Банки  гибридом.

    Для успешного сохранения выведенных видов  гибридом, для дальнейших научных  изысканий, для бесперебойного производства моноклональных антител создаются  банки гибридом – специальные учреждения для хранения культур гибридомных клеток, подвергнутых криоконсервации.

    Крупнейшим  банком гибридом (и официально на то уполномоченным на территории РФ) является Институт цитологии Российской Академии Наук, в котором при Отделе клеточных культур функционирует Коллекция клеточных культур.

    Коллекция клеточных культур Института  цитологии РАН основана в 1978 году. Основным организатором является руководитель отдела клеточных культур, профессор  Георгий Петрович Пинаев. На протяжении 27 лет происходит непрерывное расширение и совершенствование ее фондов. В фондах Коллекции культур клеток позвоночных содержится около 200 клеточных линий и 690 гибридом, которые представлены в виде 300 000 ампул, хранящихся в жидком азоте в криобанке. Коллекция обладает уникальным комплексом оборудования, приборов и устройств, обеспечивающих ее деятельность. Коллекция является Центром коллективного пользования, обеспечивая образцами коллекционного клеточного материала учреждения Санкт-Петербурга, России и стран СНГ.

    Коллекция клеточных культур ИНЦ РАН является Центральным банком, официальным органом по депонированию новых клеточных линий и гибридом, а также научно-методическим центром Российской коллекции клеточных культур. Коллекция является членом общественной организации "Ассоциация специалистов по клеточным культурам". Президентом этой организации является Г. П. Пинаев, вице-президентом - Г. Г. Полянская. Российская коллекция клеточных культур является членом Европейской Ассоциации клеточных культур (ECCO) и Всемирной Федерации Коллекций Культур. Информация о фондах Коллекции представлена в Международном Каталоге линий Human and animal cell lines catalogue, 1993 (Interlab. project). Данные об имеющихся в Коллекции гибридомах включены в Международную базу данных Всемирной Федерации Коллекций Культур.

    Направления работы:

1. Поддержание и развитие Коллекции культур клеток позвоночных.
2. Получение и характеристика постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека.
3. Сравнительный анализ кариотипической изменчивости в клеточных линиях с разной структурой кариотипа при длительном культивировании в разных условиях.

    Основные  задачи, решаемые в  процессе работы Коллекции:

1. Развитие и непрерывное поддержание фондов Коллекции путем сбора, выведения, паспортизации и хранения клеточных линий человека и животных. В рамках расширения фондов Коллекции ведется работа по получению постоянных линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, являющихся перспективным материалом, как для фундаментальных, так и для биомедицинских исследований.
2. Разработка типового паспорта и единых требований к качеству коллекционного клеточного материала, согласно требованиям, принятым в Международной федерации Коллекций Культур. Паспортизация клеточных линий включает описание условий культивирования и криоконсервации, определение жизнеспособности клеток, их морфологии, видовой идентификации клеточных линий с помощью кариологического и изоферментного анализа; микробиологический контроль клеточных линий; помимо классических микробиологических методов контроля, для определения микоплазменной контаминации применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров к рибосомальному гену микоплазм. Работы с ЭСК человека требуют использования специальных методов культивирования и характеристики недифференцированных ЭСК и полученных из них различных типов дифференцированных клеток. К таким методам, в частности, относятся иммуно-флуоресцентный, цитохимический и молекулярно-биологический анализы ЭСК человека.
3. Депонирование уникальных клеточных линий и гибридом, патентуемых в связи с их практической ценностью.
4. Постоянное совершенствование работы с коллекционными клеточными культурами на основе проведения многолетних научных исследований, посвященных изучению влияния условий культивирования, криоконсервации и контаминации на генетическую изменчивость клеточных линий. В результате проведения многолетних исследований по кариотипической изменчивости в разных клеточных линиях установлен ряд закономерностей, обеспечивающих образование сбалансированной кариотипической структуры клеточной популяции как единой автономной системы в условиях in vitro.
5. Создание информационных баз данных по клеточным культурам и постоянно действующей службы информации путем регулярного издания информационного бюллетеня. Начиная с 1986 года, издано 20 выпусков бюллетеня "Клеточные культуры". В 1991 году был выпущен первый каталог клеточных линий Всесоюзной коллекции клеточных культур. В 1999 году выпущен расширенный каталог Российской коллекции клеточных культур на русском и английском языках объемом 429 страниц (РККК).
6. Обеспечение образцами стандартного и полностью охарактеризованного клеточного материала фундаментальных и прикладных биологических, медицинских, сельскохозяйственных и биотехнологических исследований. Ежегодно выдается более 150 образцов клеточных линий в многочисленные организации Санкт-Петербурга, других регионов России и стран СНГ.
7. Оказание научно-методической помощи сотрудникам научных учреждений страны по методам культивирования и анализу клеточных линий путем проведения стажировок, а также путем издания методических руководств, проведения конференций, совещаний и школ.

    4.применение  моноклональных антител.

    4.1.Что  такое моноклональные  антитела.

    Моноклональные  антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны на почти любое вещество (в основном белки и полисахариды), которое антитело будет специфически связывать.

    Они могут быть далее использованы для  детекции(обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается на -mab (от английского «monoclonal antibody»).

    4.2.Метод  получения.

    На  настоящий момент единственным успешным методом создания моноклональных антител  является метод гибридомной технологии. Технология лимфоидных гибридом была разработана в 1975 году Мильштейном и Келлером, и уже к 1977 году ими было получено 16 типов гибридом, синтезирующих различные типы моноклональных антител. Первоначально гибридомная технология строилась на основе следующих разработок: имелись линии миеломных клеток мышей balb/c (дефектные по некоторым ферментам метаболизма нуклеиновых кислот, что являлось необходимым условием для селекции получаемых гибридом), полученные в результате развития методов получения миелом, посредством введения инертного пластика и минеральных масел в виде подкожных инъекций мышам; разработаны методы слияния клеток с помощью вирусов (вирус Сендай) и полиэтиленгликоля; разработаны методики избирательной селекции клеток с помошью среды ГАТ. Главной заслугой Мильштейна и Келлера явилась непосредственно разработка методики, а также возможность использования получаемых гибридом для широкомасштабного производства моноклональных антител.

    На  настоящий момент данная технология не претерпела практически никаких  изменений. В качестве клеток-носителей все чаще начинают использование клеток других типов, полученных либо от организма одного вида, либо даже от разных видов. Разработка подобных методов позволяет не только изучить особенности функционирования клеток как таковых, но и имеет колоссальный практический интерес, т.к. позволяет решить проблему получения человеческих гибридом.

    4.3.Применение  моноклональных антител.