Лабораторная диагностика инфекций, передаваемых половым путём

     Диагноз уретрита у женщин подтверждается нахождением  более 10 лейкоцитов в поле зрения при  увеличении микроскопах 1000, Следует  помнить, что если во влагалище и/или  шейке матки имеется патологический воспалительный процесс и при этом наблюдаются выделения из влагалища, уретральный мазок всегда загрязнён материалом этих выделений (клетки плоского эпителия, лейкоциты, вагинальная микрофлора) и не годится для дальнейшей оценки, поскольку он не имеет ничего общего с уретрой.

4. Оценка  результатов микроскопии окрашенных мазков.

     На  основании микроскопического исследования диагноз гонореи устанавливается  по трем признакам гонококка:

• его форме;
• расположению;
• окраске.

     Если  же отсутствует хотя бы один из них, требуется культуральное исследование.

     Решающее  значение при микроскопической диагностике  гонореи имеет учет расположения диплококков. Гонококки в основном располагаются внутри лейкоцитов и эпителиальных клеток. На основании обнаружения диплококков, расположенных вне клеток, микроскопический диагноз гонореи не ставится, требуется культуральное исследование.

     Окраска гонококков (по методу Грама) - красно розовая (грамотрицательный диплококк). При этом ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток окрашиваются т фиолетовый цвет.

     Оценка мазков, окрашенных метиленовым синим

     При микроскопии препарата видны:

• ядра клеток, окрашенные в синий цвет;
• цитоплазма, окрашенная в голубой цвет разной интенсивности;
• бактериальная микрофлора, окрашенная в синий цвет разной интенсивности.

     Окраска метиленовым синим является ориентировочной  и позволяет оценить морфологию (форму) и расположение микроорганизмов  в мазке (внутри лейкоцита и на эпителиальных клетках).

     Оценка мазков, окрашенных по Граму

     Методика  оценки мазка, окрашенного по Граму, принципиально не отличается от методики оценки мазка, окрашенного метиленовым  синим. Окраска по Граму позволяет  выделять в картине мазка красно-розовые (грамотрицателъные) или сине-фиолетовые (грамположительиые) элементы. Основной целью исследования является выявление  грамотрицательных диплококков  со специфической морфологией, а  также степени выраженности лейкоцитарной  реакции.

     2.3.2 Культуральное (бактериологическое) исследование

     Дополнительно к микроскопии окрашенных мазков бактериологическое исследование на гонорею  должно всегда проводиться при обследовании:

• детей, так как у них встречается большое количество непатогенных нейссерий. особенно в полости рта, глотки и гениталиях;
• женщин, так как диагностическая чувствительность микроскопии генитальных мазков женщин низкая;
• пациентов с бессимптомной и экстрагекитальной гонореей (глотки, прямой кишки, конъюнктивы и др.);
• сексуальных контактов пациентов с доказанной гонореей (где при микроскопии не удалось выявить возбудителя);
• пациентов с гонореей после окончания лечения(не раньше 10 дней) и при снятии их с учета;
• с целью окончательной идентификации нейссерий;
• для определения чувствительности нейссерий к антибиотикам;
• в случае если будет проводиться фенотипическая и/или генотипическая диагностика N. gonorrhoeae;
• в случае сексуального насилия, при запросе следственных органов и/или судебно-медицинских экспертов.

     Ответ по результатам посева при выделении  чистой культуры и её идентификации  выдаётся через 5 дней после взятия пробы.

1. Проведение  бактериологического анализа

     Подученный  биологический материал необходимо сразу же поместить одновременно на селективную и неселективную  питательную среду, поскольку некоторые  штаммы гонококков чувствительны к  концентрациям ванкомицина и  триметоприма, входящих в состав селективной  среды.

     Культивирование гонококков следует проводить на чашках Петри диаметром 90 мм с количеством  среды не менее 20 мл на чашку или 100 мм с количеством среды 26 мл. После  приготовления чашек со средой они  ставятся в термостат при 36±1°С на 1 час для удаления конденсата (излишней влажности). Пересушивание среды  недопустимо, т.к. это отразится на качестве роста гонококков. Перед проведением посева чашки необходимо прогреть в термостате при температуре +36±1°С в течение 30 минут.

     Клинический материал от каждого пациента должен засеваться на отдельную чашку Петри. При использовании больших чашек (90 или 100 мм) материал из уретры и цервикального  канала у женщин может засеваться на одну чашку Петри в разные ее секторы с соответствующей маркировкой. Материал из уретры мужчин должен засеваться на отдельную чашку.

     Взятый  материал тампоном наносится на поверхность. Затем стерильной бактериологической петлей материал распределяется по площади поверхности питательной среды штриховыми движениями в 3 - 4 разных на правлениях с целью создания условий для роста отдельно расположенных колоний гонококков. Чашки немедленно помещаются в анаэростат с содержанием СО₂ 5±2%. влажностью 70%, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±1⁰С. Допускается использование эксикатора, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±1⁰С, в эксикаторе создаются условия повышенного содержания СО₂ при помощи свечении газогенерирующих пакетов и влажности. Чашки просматриваются через 18 - 24 часа инкубации, в случае отсутствия роста - через 48 часов:

• При отсутствии признаков роста через 72 часа инкубации наблюдение прекращают.
• При выявлении характерных колоний проводится первичная и видовая идентификация.

2. Идентификация нейссерии

     Первичная идентификация  нейссерии проводится путем:

• визуальной оценки вида колоний,
• окраски материала подозрительных колоний по Граму;
• оксидазного теста.

• Оценка  вида колоний

     Типичные  колонии гонококков через 18 - 24 часа инкубации выпуклые прозрачные серо-белого цвета, имеют диаметр 0,5 - 1,0 мм. При дальнейшей инкубации колонии могут увеличиваться в размерах до 3,0 мм и уплощаться. Нередко на одной чашке можно встретить колонии разного вида.

     Большие трудности возникают при идеитификации  колоний гонококка в посевах  из ротоглотки, т.к. при этом часто вырастают менингококки и непатогенные нейссерии, колонии которых сходны с колониями гонококков. Колонии менингококка выглядят голубоватыми, колонии непатогенных нейссерии - беловатыми, а гонококков - бесцветными, слизистыми. Размер, цвет, морфология и консистенция колоний могут варьировать в зависимости от применяемой питательной среды. Идентифицировать возбудителя можно только при определении сахаролитических свойств культур или другими тестами, подтверждающими видовую принадлежность микроорганизма.

• Применение  оксидазного теста

     Обнаружение оксидазоположительных грамотрицательных  диплококков считается достаточным  для их идентификации как N. gonorrhoeae при рутинной диагностике. Для определения цитохром-с оксидазы можно использовать один из рекомендованных методов:

• На подозрительную колонию наносится капля оксидазного реагента {тетраметилфенилендиамина, 1%-ный водный раствор). Быстрое изменение цвета реагента, в течение 5 - 10 секунд, на сине-фиолетовый и его сохранение дольше 30 секунд позволяет считать тест положительным. Реагент, используемый в оксидазном тесте, убивает гонококки, поэтому дальнейшая работа с этими колониями будет невозможна.
• Полоска фильтровальной бумаги смачивается несколькими каплями реагента, затем на нее помещается бактериологической петлей материал из подозрительной колонии. Этот способ позволяет сохранить материал на чашке для проведения дальнейших исследований. Высокая чувствительность оксидазного теста не согласуется с его специфичностыо. Оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, выделяющие цитохромную оксидазу, поэтому оксидазоположнтельные колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать микроскопически с окраской по Граму.
• Имеются коммерческие диски и полоски, содержащие диметил-р-фенилендиамина гидрохлорид. Платиновой петлей или стерильной стеклянной палочкой испытуемую культуру наносят на диск, предварительно слегка смоченный дистиллированной водой.

     Учет  результата

     Темно-лиловое  или синее окрашивание, появляющееся через 10 - 30 секунд, свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Отсутствие изменения цвета - об отсутствии данного фермента.

     При исследовании мазков, окрашенных по Граму, из культур учитываются морфология, расположение и окраска гонококков. После 18 - 24 часов культивирования гонококки представляют собой скопления грамотрицательных кокков и диплококков, имеющих более компактное расположение микроорганизмов в центре и разреженное и неравномерное распределение по периферии.

     Наряду  с интенсивно окрашенными в розово-красный  цвет кокками встречаются и бледно-окрашенные формы. Более старые культуры (48 часов и более) трудно интерпретировать, т.к. отмечается большое количество полностью лизированных клеток. По мере старения культуры увеличивается полиморфность гонококков.

     Для подтверждающей идентификации нейссерий  используются тесты:

• изучение ферментативной активности;
• иммунологические тесты (прямая иммунофлюоресценция, коагглютинация);
• молекулярно-биологические методы (ПЦР).

3. Изучение  ферментативной активности

     Ферментативная  активность Neis. gonorrеае изучается в реакции окисления сахаров. Реакция может быть ложноположительной из-за контаминации исследуемых культур гонококков другими бактериями и ложноотрицательной при использовании гонококков, культивируемых более 24 часов (вследствие аутолиза микроорганизмов). Для предупреждения этих возможных факторов необходимо выделить чистую культуру гонококков путем пересева типичных колоний на чашки Петри с неселективной средой (шоколадный агар). Инкубация проводится в течение 18 - 24 часов.

     Изучение  ферментативной активности Neis. gonorrhoeae может проводиться в ростозависимых и ростонезависимых тестах. При проведении ростозависимых тестов сахара и другие субстраты (например, феноловый красный) вводятся непосредственно в питательную среду, на которой осуществляется рост гонококка. Однако в настоящее время эти тесты не могут быть рекомендованы, т.к. широко используемые ростонезависимые тесты дают возможность получить более быстрый (в течение нескольких часов) и специфический результат, позволяя идентифицировать исключительно Neis. gonorrhoeae и исключить другие непатогенные нейссерий. Существуют коммерческие наборы для изучения ферментативной активности Neis. gonorrhoeae.

     Оценка  проводится по изменению цвета среды: при ферментации сахаров - от красного к желтому (результат положительный). Энзимсубстратные тесты с использованием ферментов (орто-нитрофенил-бета-галактозидаза (ONPG), гамма-глютамил аминопептидаза (GLU-AMP), гидроксипролил аминосинтидаза (PIP), гидроксипролин аминопептидаза (НРА), пролин аминопептидаза (Рго-АР)) предназначены для быстрой дифференциации между N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. tacarnica и некоторыми штаммами N. cinerea и N. Catarrhalis. Результаты теста считаются положительными, если происходит изменение цвета среды - от бесцветного к желтому для ОФГ и от светло-желтого к интенсивно оранжевому для Глю-АП и Про-АЛ. Однако чувствительность и специфичиость этих быстрых энзимсубстратных тестов оказались неоптимальными.

     Проведение  видовой идентификации возможно также с использованием бактериологических анализаторов и коммерческих наборов  реагентов.

4. Иммунологические/антигенные подтверждающие тесты

     Иммунологические  тесты рекомендуется использовать только в референс-лабораториях для  окончательного подтверждения N. gonorrhoeae.