Питательные среды

Некоторые  виды  микробов обладают высокой чувствительностью к  воздействию определенных факторов внешней среды. Индивидуальная устойчивость микробов к тому или иному фак  тору была использована для разработки методов выделения чис тых  культур путем умерщвления сопутствующей  микрофлоры, Этим способом производится выделение споровых форм микро бов, устойчивых к действию высокой температуры, микробак терий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных  растворов  минеральных кислот,  в отличие от остальных микробов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из па тологического    материала,    загрязненного    посторонней    микрофлорой,  прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроба, который пред полагается выделить из исследуемого материала. Биологически:; метод выделения чистой культуры применяется при исследова нии мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

 Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры. Однако получение отдельной ишии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то к ней часто прикрепляются посторонние формы. В случае выделения штам- Bacillus или актиномицетов контаминирующие микрооргазмы могут быть опутаны цепочками клеток или соответственно гифами этих бактерий. Для очистки предпочтительнее использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Но се на неселсктивной среде не следует очень быстро отбирать ролонии, поскольку за данный отрезок времени могут еще не врасти медленно растущие контаминирующие бактерии. Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии при микроскоп и ровании выявляются похожие клетки, в част-ги по размеру и окраске по Граму. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, гогут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых кльтурах различных микроорганизмов могут появиться кокко-видные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Тем не менее ука-анные критерии широко используются при определении чисто-культур.

Посев штрихом

Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами («штрихованные чашки»), но лишь некоторые из почти всегда дает хорошо изолированные колонии даже при сутствии навыков у экспериментатора. Кроме того, можно назвать разведенные  растворы смешанной культуры на поверх- твердых сред в чашках. При работе с анаэробами «штрихованные чашки» или чашки с внесенной в  них жидкой культурой в атмосфере  воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные  среды, и посев штрихом следует  проводить в течение первых 4 ч  после их авто-клавирования, чтобы  избежать накопления растворенного кислорода.

 

 

 

 

 

 

              В

 

Рис. 6.

Удобный метод посева штрихом в  чашки для получения отдельных  колоний. А. Для мар кировки на обратной стороне чашки Петри  карандашом наносят букву Т, разделяющую  дно на 3 сектора. Б. Петлей с культурой  зигзагом наносят штрихи на поверхности  агара в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки  сначала приподнимают, а после  нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с). В Проводят петлей по поверхности среды в секторе I, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3, Д. Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как показано на рисунке, для того чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появлякмся отдельные хорошо изолированные колонии.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине  среды (по Коху)

Три пробирки, содержащие по 15 мл мясо-пептонного агара, ставят п водяную баню для  расплавления агара. Расплавленную  среду остужают до температуры 43—45С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок.

После застудневания среды с  исследуемым материалом чаш-ки помешают в термостат. Количество колоний  в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского

Расплавленную питательную среду  разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно  подсушивают, так как влажная  поверхность ее способствует образованию сливающегося роста. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во вторую и третью чашки, нтирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, тляетсы наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют параллельными гтрихами но всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 180°, проводят штрихи н направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется постепенно, и по линиям еткя, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов

Анаэростат — прибор для выращивания  микробов в анаэробных условиях —  представляет собой толстостенный  металлический цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой  имеются вакуумметр и два крана  для присоединения к вакуум- насосу.

Методы, позволяющие изучить  культуральные свойства микроорганизмов

Культуральные признаки микробов определяются характером роста их на питательных  средах. Будучи постоянными для каж дого  вида  микроба,   они   являются   важным  диагностическш признаком.

Рост микробов на плотной  питательной среде

Для изучения свойств колоний микробы  культивируют на плотных питательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помешают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и с суженой диафрагмой.

Колонии характеризуют по величине, форме,  контуру края рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции,

Величина колонии определяется ее диаметром. В зависимое от диаметра различают колонии точечные (диаметр  меньше мм), мелкие (диаметр  1—2  мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр  А—6 мм и более).

Форма колонии бывает правильная —  круглая, неправильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев.

Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные. Последние делят на:

1) фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округлых или уплощенных зубцов правильной формы;

2) волнистый   край,   который   несколько   отличается   от   фестончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;

3) эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;

4) бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки. В некоторых случаях четко выраженная линия, отграничивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.

Рельеф колонии характеризуется  приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку. Различают:

 1) каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы с различно выраженной степенью выпуклости, которые в вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются только ДЛИНОЙ радиуса. Колонии слабо выпуклые имеют большую длину радиуса; куполообразные - меньшую;

2) колонии плоско-выпуклые с плоским верхом, пологими или круто обрывающимися краями; имеют в вертикальном разрезе форму трапеции;

3) колонии конусообразные, имеющие  в вертикальном разрезе форму  треугольника:

4) колонии с приподнятой п  виде соска серединой и валиком  по периферии;

5) колонии с вдавленным центром;

6) колонии плоские, стелющееся  по поверхности среды.

Поверхность колонии изучают с помойную лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая пли шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Механизм формирования гладких и шероховатых форм колоний обусловлен различием процессов клеточного деления. Микробные клетки в колониях S-форм располагаются, соприкасаясь своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, образуют цепочки, которые, накладываясь друг зa друга, обусловливают шероховатую поверхность и неровный крав колонии.

Переход S-форм в R формы наблюдается при диссоциации. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается под действием антибиотико- и химиотерапии, факторов специфичекого иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также факторов внешней среды. Среди шероховатых форм колоний различают: складчатые, гирозные, по виду напоминающие   исчерченную   извилинами   поверхность   мозга; бородавчатые,   концентрически  или   радиально   исчерченные; шагреневые, т. е. мелкозернистые.

Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура  микробов.   Преобладающее  большинство  патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бес-цветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В прохо-. дящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

Структура колоний определяется в  проходящем свете слабом увеличении микроскопа, суженой диафрагме или  при несколько опушенном конденсоре. У пигментированных колоний и  колоний, не пропускающих света, она  не определяется.

По характеру структуры различают  следующие виды колоний:

1) гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

2) зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко- и грубозернистые;

3) нитевидные или волокнистые, характеризующиеся наличием длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии.

Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть от личается   от   периферической   или   отдельные   сектора   имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

Консистенцию колонии, определяющую ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной, петлей. По характеру конси стенции колонии бывают:

1) пастообразные,  легко  снимающиеся  и  размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

2) вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;

3) волокнистые   или   кожистые, плотные,   снимающиеся   с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соответствующей величине и форме колонии;

4) хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

 Особенности микробного роста на жидких питательных средах

На жидких питательных средах характер роста микробов ме нее разнообразен, чем на плотных питательных средах. Однако и здесь иыявлены следующие  формы роста бактерий.

Рост бактерий с равномерным помутнением среды, цвет которой остается неизмененным или изменяется в соответствии с цветом водорастворимою пигмента, образующегося в культуре микроба. Такой рост характерен для многих патогенных бактерий, относящихся к группе факультативных анаэробов.

Придонный рост бактерий характеризуется  образованием осадка на две пробирки с жидкой питательной средой. Осадок может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции вязким, слизистым, хрупким или пастообразным. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды, находящейся над ним, определяется наличием пигмента, продуцируемого культурой микробов. Если культура пигмента не образует, цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как правило, серовато белый или желтоватый цвет. Придонный рост специфичен для бактерий с анаэробным типом дыхания.

Пристеночный рост бактерий выражается н том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные рыхлые хлопья или, наоборот, компактные зерна, прикрепленные к внутренней поверхности стенок сосуда, с которых в зави-симости от вида бактерий снимаются легко или с трудом.