Зеленый флуоресцирующий белок

     Была  продемонстрирована эффективность исследования FRET между мутантами GFP в белке слияния в качестве внутриклеточного индикатора NO. В этой работе для прямого изучения взаимодействия между металлотионеином (МТ) и NO в живых клетках авторы получили белок слияния, состоящий из МТ, расположенного между циановым (ECFP, донором) и желтым (EYFP, акцептором) мутантами GFP, присоединенными к N- и С-концу МТ, соответственно. Металлотионеины – это внутриклеточные богатые цистеином металлсвязывающие белки с молекулярной массой от 6 до 7кДа. При реакции с NO металлотионеин высвобождает цинк или кадмий. Полученный в результате белок слияния сохранил способность связывать ионы металлов. Добавление ЭДТА и хлорида натрия, вызывающее высвобождение металлов из МТ и его разворачивание, приводило к уменьшению отношения интенсивностей флуоресценции при 535 нм (акцептор) и 480 нм (донор), F₅₃₅ нм / F ₄₈₀ нм от 1,8 до 1,1. Более того, добавление Cu1+ к лизату клеток повышает эффективность FRET, что проявляется по увеличению F₅₃₅ нм / F ₄₈₀ нм от 1,8 до 2,2. Таким образом, конформационное изменение при высвобождении или связывании металла может быть прослежено с помощью Ферстеровского переноса энергии, который отражает изменения межмолекулярного расстояния и относительной ориентации флуорофоров в ECFP и EYFP (рис. 1). Аналогичная картина наблюдалась при добавлении водного раствора NO к лизату клеток, содержащему белок слияния, когда соотношение F₅₃₅ нм / F ₄₈₀ нм уменьшилось от 1,8 до 1,4. Как было показано, NO не изменяет эффективность переноса энергии у свободной от металла формы белка слияния. Применение химерной конструкции на основе GFP обнаружило индуцированное NO конформационное изменение в МТ, указывающее на высвобождение металла, таким образом впервые было продемонстрировано высвобождение металла из МТ в ответ на физиологические стимулы в интактных клетках.

 Рис. 1. Пример типичного использования FRET для наблюдения за конформационными изменениями.Связывание ионов металлов металлотионеином приводит к возникновению плотной упаковки химерной конструкции, в результате чего происходит перенос энергии между ECFP и EGFP.Высвобождение ионов металлов, наоборот, приводит к разворачиванию конструкции и, следовательно, уменьшению FRET .

      Одним из наиболее важных достоинств метода FRET является пространственное (субмикроны) и временное (миллисекунды) разрешение. Наиболее существенным недостатком можно считать то обстоятельство, что перенос энергии наблюдается и в отсутствие каких-либо белковых взаимодействий, наличие этого фонового уровня сужает динамический диапазон измеряемых концентраций. 

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, прижизненные (или живые, live colors) маркеры являются уникальными инструментами, которые позволяют в живой, постоянно меняющейся клетке отслеживать процессы, развивающиеся на очень быстрой временной шкале. При этом клетка практически не подвергается стрессовому воздействию при введении меченых соединений, а биохимические нарушения в клетке в целом минимальны.Это особенно важно в настоящее время в нейробиологии, где, как известно, молекулярные события, связанные с передачей сигнала, опосредованы изменением концентрации кальция и развиваются на временной шкале от десятых до сотых долей секунды.