Зеленый флуоресцирующий белок

I. ВВЕДЕНИЕ

Зеленый флуоресцирующий белок (GFP) используется в качестве прижизненного маркера, позволяющего исследовать многообразные процессы, происходящие внутри живых клеток и организмов, что ранее было практически невозможным. Этот белок кодируется одним геном, его хромофор образуется из трех аминокислотных остатков Ser65–Tyr66–Gly67 путем внутренней посттрансляционной автокаталитической циклизации, которая не требует каких бы то ни было кофакторов или субстратов. Слияние GFP с другими белками обычно не влияет на активность, подвижность и локализацию этих белков в клетке. Сообщалось о некоторой токсичности высоких концентраций GFP внутри клетки, однако эти данные не подтвердились. Исключительно важна устойчивость GFP к различного рода протеазам и изменению рН, что позволяет ему длительное время сохраняться и накапливаться внутри клетки.Поскольку частотность использования кодонов в клетках различной природы различна, были созданы мутанты с оптимизированными кодонами для исследования клеток млекопитающих , растений , дрожжей и грибков . Высокое двухфотонное поглощение GFP позволяет использовать его в современных фотофизических методах, в частности в конфокальной микроскопии и ряде оптоэлектронных устройств.

     В последние годы быстро растет число  исследований с другими цветными белками, подобными GFP, но выделенными из кораллов.Недостатком этих белков является ярко выраженная склонность к агрегации, которую, однако, можно преодолеть путем мутагенеза. Опубликованы обзоры по применению GFP в технологии репортерных генов, в структурных и динамических исследованиях, для изучения динамики белков в живых клетках с использованием флуоресцентной микроскопии.Успешно исследуется локализация белков в бактериях , растениях, эмбрионах мышей. Белки слияния на основе GFP используютсядля поиска новых лекарств, для детекции апоптоза . Активно развиваются исследования по применению GFP в клеточной биологии в качестве живого маркера для изучения молекулярных и клеточных процессов в млекопитающих . GFP посвящены отдельные тома в Methods in Enzymology и Methods in Cell Biology , были выпущены CD-ромы с иллюстрациями применений GFP .Журнал Trends in Cell Biology начал публиковать серию обзорных статей по использованию GFP («Imaging biochemistry inside cells», «Visualizing chromosome dynamics with GFP», «Lighting up the cell surface with evanescent wave microscopy» ).

     GFP уже находит многочисленные применения в промышленности, например, контроль за содержанием мясных бродильных лактобацилл в колбасах и распространением бактерий, которые усваивают дизельное топливо в почвах.Несколько компаний начали выращивание трансгенных флуоресцирующих домашних животных (мыши , кролики, обезьяны ), а также растений(елки и цветы ).

II. GFP КАК  ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ МАРКЕР

В БЕЛКАХ СЛИЯНИЯ

Наиболее  часто GFP применяется в качестве маркера методом генетического слияния с другими белками. Это позволяет наблюдать за локализацией и перемещением изучаемых белков в живых функционирующих клетках и выяснить их биологическую функцию. Белки слияния создаются с использованием стандартных генно-инженерных методов. Ген GFP присоединяют в одной рамке считывания к гену, кодирующему изучаемый белок. В большинстве случаев получаемый белок слияния сохраняет функцию изучаемого белка, маркер не влияет на локализацию или активность исследуемого белка, который при этом становится флуоресцирующим.Это свойство обусловлено тем, что сам белок GFP не содержит в своей последовательности каких-либо специфических сигналов внутриклеточной локализации. Кроме того, благодаря размеру и форме GFP, его устойчивости к варьированию величины рН и редокс-потенциалов, его присоединение не является препятствием для локализации белков слияния в различных клеточных компартментах.В некоторых случаях может наблюдаться неспецифическая миграция GFP от клетки к клетке. Косвенно можно маркировать даже специфические локусы хромосом. Это достигается с помощью вставки многочисленных копий Lac оператора, которые маркируются белками слияния GFP с репрессором Lac промотора. Белки слияния на основе GFP могут использоваться в любых живых системах – от вирусов до клеток млекопитающих.

  В большинстве случаев белки слияния с GFP создаются путем присоединения изучаемого белка к N-или С-концу GFP. Длина полипептидного линкера может влиять на стабильность белков слияния на основе GFP . По данным рентгеноструктурнго анализа, С-и N-концы GFP расположены недалеко друг от друга, поэтому GFP может быть вставлен внутрь последовательности изучаемого белка во внешние петли или участки между доменами.

  Амино- (остатки 1–10) и карбоксильный (остатки 229–238) концы GFP образуют свободно движущиеся цепи, выходящие из центраструктуры β-бочонка . Эти подвижные цепи выступают в роли естественных гибких линкеров при получении белков слияния. Это объясняет, почему даже при соединении белков безо всяких линкерных последовательностей, белок GFP не «чувствует» белка партнера и, соответственно, не влияет на его сворачивание.

     Интересно, что сворачивание белков слияния  с GFP во многих случаях предотвращает образование телец включения. Методами флуоресцентной корреляционной спектроскопии и анизотропии флуоресценции с разрешением во времени была изучена вращательная динамика белка слияния на основе мутанта GFP (F64L/S65T), соединенного через линкер из трех аланинов с Fv фрагментом антителапротив липополисахарида внешней клеточной стенки грамотрицательных бактерий Ralstonia solanacearum. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия использовалась для измерения коэффициентов диффузии самого GFP и в белке слияния с scFv. Измерения затухания анизотропии флуоресценции проводились для изучения вращательного движения GFP компонента в scFvGFP. Полученное время вращательной корреляции белка слияния GFP с одноцепочечным антителом (15,8 нс) было слишком мало по сравнению с рассчитанным в приближении глобулярного вращения всей молекулы, которое должно превышать 20 нс. Время вращательной корреляции для одиночной молекулы GFP составило 10,6 нс. Полученный результат можно объяснить тем, что оба белка отделены друг от друга гибким шарниром, благодаря которому они могут свободно двигаться, не мешая друг другу. Это предположение было подтверждено созданной авторами структурной моделью белка слияния scFv-GFP , которая показала, что оба партнера в белке слияния ведут себя независимо, подобно тому, как они вели себя по одиночке.

     Конструкция scFv-GFP легко узнает свой антиген, поскольку не существует пространственных помех, и антигенсвязывающий участок полностью экспонирован в растворитель. Исследование экспрессии белка может быть мощным инструментом для понимания его функций, при условии, что этот белок экспрессируется в физиологически значимых концентрациях.Был разработан простой метод для измерения концентрации суперэкспрессированного белка в отдельных клетках и соотношения конкретных физиологических свойств с экспрессией белка, участвующего в поддержании кальциевого гомеостаза. Нейронный кальциевый гомеостаз обусловлен взаимодействием между компонентами, которое увеличивает или уменьшает уровень содержания кальция в цитоплазме. Измеряя флуоресценцию белка слияния нейронспецифичного кальций связывающего белка кальретинина и GFP в микрокапиллярах, была получена стандартная кривая флуоресценции GFP,которая позволила количественно определить концентрацию кальретинина в отдельных клетках, при этом было показано, что различные уровни экспрессии белка слияния коррелируют с функциональнымиразличиями отклика клеток на кальций. Этот метод делает возможным количественно соотнести специфические внутриклеточные изменения уровня кальция с изменением количества белка, экзогенноэкспрессированного в этой же клетке.

III. GFP КАК  РЕПОРТЕРНЫЙ ГЕН

Ген GFP, находящийся под контролем определенного  промотора, можно использовать для оценки уровня экспрессии других белков, ген которых находится под контролем того же промотора. Используемые в качестве репортеров для наблюдения за активностью гена и распределением белка внутри клеток β-галактозидаза, люцифераза светляков и бактериальная люцифераза требуют добавления внешних субстратов или кофакторов. Однако во многих случаях, как, например, в случае нематоды Caenorhabditis elegans, в котором кутикула препятствует доступу субстратов ферменты-репортеры могут использоваться ограниченно.

  Показано, что гетерологичная экспрессия GFP в прокариотических (E. coli, под контролем Т7 промотора) и эукариотических (C. elegans, под контролем mec7 промотора, который управляет формированием β-тубулина в механочувствительных нейронах) клетках, сопровождается появлением интенсивной зеленой флуоресценции, возбуждаемой синим светом. GFP может быть использован как прижизненный маркер, так что за клеточным ростом,развитием нейронных процессов и движением можно следить in situ, особенно в животных, ткани которых достаточно прозрачны (как у C. elegans и Zebra fish ) .

     В ряде случаев применение GFP в качестве генетического маркера несколько ограничено вследствие относительно низкой чувствительности метода. Дело в том, что в зеленой области спектра живые клетки обладают сильной собственной флуоресценцией, поэтому для получения сигнала флуоресценции, вдвое превышающего фоновый в клетке млекопитающих, требуется 1 мкМ GFP дикого типа.ЕGFP с более высоким коэффициентом поглощения уменьшает предел обнаружения флуоресцирующего белка в 6–10 раз (0,1 мкМ GFP или 105 копий на типичную клетку объемом 1–2×10–12л). Таким образом, для детекции интегрального сигнала от клетки нужен достаточно сильный промотор, чтобы запустить достаточную для детектирования экспрессию GFP, особенно в клетках млекопитающих (например, промоторы из вирусов, таких как цитомегаловирус, SV40, длинный концевой повтор ВИЧ, или сильные экзогенные регуляторы, такие как тетрациклиновая система трансактивации) . Чувствительность детекции экспрессированнного флуоресцирующего белка может резко увеличиться за счет его кластеризации, обусловленной сигналом внутри

клеточной локализации. Например, кластер из 300–3000 молекул GFP, упакованных в центросоме, при микроскопическом наблюдении становится хорошо видимой зеленой точкой внутри клетки. Совершенствование детектирующей техники позволяет дополнительно понизить число минимально детектируемых молекул GFP .

  Медленное посттрансляционное образование хромофора и стабильность образующегося белка также ограничивают использование GFP для исследования быстрых транскрипционных процессов активации. Полупериод жизни EGFP, экспрессированного в цитоплазме клеток млекопитающих, превышает 24 часа. Такой уровень стабильности является преимуществом при решении многих прикладных задач, для которых желателен стабильный флуоресцентный сигнал от GFP. Однако это является серьезным недостатком при наблюдении за изменением экспрессии гена. При проведении анализов с использованием репортеров транскрипции предполагается, что изменения в уровне репортерного белка отражают изменения в уровне мРНК, вызванные или индукцией или подавлением контролирующего элемента, соединенного с репортерным геном. В частности, при индукции вслед за введением какоголибо эффектора (например, потенциального лекарства) реальный уровень репортерного белка может возрасти в меньшей степени, чем наблюдаемое увеличение созревшего белка из-за высокого базового уровня репортерного белка, уже накопившегося в клетке. Эти ограничения GFP как репортера транскрипции привели к разработке короткоживущих форм EGFP , названных дестабилизированными EGFP (dEGFP). Дестабилизированные dEGFP варианты были получены путем присоединения гена, кодирующего 422–461 аминокислотные остатки мышиной орнитиндекарбоксилазы (MODC), к С-концу гена EGFP. Этот домен MODC содержит аминокислотную последовательность, которая делает белок восприимчивым к быстрому протеолизу 26S протеосомой при экспрессии в клетках млекопитающих. Белок слияния EGFPMОDC422–461(d2EGFP) имеет кажущийся полупериод жизни (время, за которое флуоресценция уменьшается в 2 раза) 2 часа в присутствии циклогексимида. Как было показано, это уменьшение флуоресценции, следующее за ингибированием синтеза белка, соотносится с аналогичным уменьшением уровня белка d2EGFP. Избирательным мутагенезом ключевой аминокислоты внутри участка MОDC422–461 было получено два дополнительных мутанта с полупериодами жизни 1 ч (d1EGFP) и 4 ч (d4EGFP). В принципе, аналогичным способом можно создать дестабилизированные синий (EBFP), циановый (ECFP) и желтый (EYFP) варианты и, используя этот набор короткоживущих спектрально различных вариантов, анализировать разные сигнальные пути трансдукции в одной и той же клеточной линии. Однако не стоит забывать, что между экспрессией белка и детектированием флуоресценции проходит некоторое время, требуемое на посттрансляционное созревание хромофора GFP, поэтому использование дестабилизированных EGFP вариантов может быть проблематичным при наблюдении за очень быстрыми или кратковременными изменениями в экспрессии гена.

IV.МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА ИНДУКТИВНОМ И РЕЗОНАНСНОМ (ФЕРСТЕРОВСКОМ) ПЕРЕНОСЕ ЭНЕРГИИ (FRET)

     Индуктивно-резонансный перенос энергии (или Ферстеровский перенос энергии) – это безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения, происходящий между двумя флуорофорами, когда они находятся на малом расстоянии (<100 D), и спектр излучения одного флуорофора (донора энергии) перекрывается со спектром поглощения другого флуорофора (акцептора энергии). Эффективность FRET зависит также от взаимной ориентации донора и акцептора.При благоприятных для FRET условиях возбуждение донора приводит к флуоресценции акцептора, при этом интенсивность флуоресценции донора уменьшается . Спектры поглощения и флуоресценции большинства флуоресцирующих белков перекрываются, что делает их хорошими парами для FRET . Рассчитанные значения Ферстеровского радиуса (расстояния, при котором эффективность переноса составляет 50%) между разными комбинациями улучшенных вариантов GFP или DsRed варьируют в диапазоне от 10 до 56,4 D .

      Любое изменение расстояния или взаимной ориентации пары флуорофоров будет влиять на эффективность переноса энергии. Поэтому FRET является одним из наиболее эффективных методов для изучения

белок-белковых взаимодействий in vivo и in vitro .Одним из главных достоинств метода является то, что флуоресценцию донора и акцептора можно измерять одновременно и об эффективности переноса можно судить по отношению интенсивностей флуоресценции при двух длинах волн, соответствующих излучению донора и акцептора. При таком методе сводятся на нет различия в абсолютной концентрации GFP. При этом не требуется дополнительной калибровки для каждого измерения. Калибровка, как правило, выполняется только один раз (in vitro), поэтому метод практически идеально подходит для анализа внутриклеточных процессов.

      Измерение переноса энергии между вариантами GFP лежит также в основе ряда методик определения ионов кальция, субстратов, используемых для оценки активности протеаз и киназ in vivo. Так, например, в работе  для наблюдения в клетках Cos-7 за активацией специфических каспаз  in vitro и in vivo во время инициации фазы выполнения программированной смерти клеток были использованы флуоресцирующие субстраты, специфически расщепляемые каспазой-1 или каспазой-3. В случае in vitro экспериментов эти субстраты состояли из сайта узнавания из четырех аминокислот, YVAD для каспазы-1 и DEVD для каспазы-3, помещенного между синим флуоресцирующим белком (BFP) и зеленым флуоресцирующим белком (GFP). Для in vivo экспериментов YVAD и DEVD были помещены между циановым и желтымм флуоресцирующими белками.Иногда GFP используется с другими партнерами, отличными от GFP-подобных белков.