Санитарная микробиология,род Сальмонелла

Посевы на среде Раппопорта-Вассилиадиса инкубировала при 41,5±1°С, а на тетратионатной – при 37±1°С в течение 24ч.

 

2.3. Характеристика плотных  элективных сред и методика  посева на них

Полученные культуры пересевают на две селективные агаризованные среды:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-aгap) и

- на одну из следующих  агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар [13].

В состав висмут-сульфит агара входят: пептический перевар животной ткани, мясной экстракт, глюкоза, натрия гидрофосфат, железа сульфат, висмута сульфит, бриллиантовый зеленый, агар-агар. Бриллиантовый зеленый и сульфит висмута подавляют рост грамположительных и кишечных грамотрицательных микроорганизмов. Ввиду высокой селективности среды на нее наносят большой инокулюм (грамположительные и колиформные микроорганизмы активно подавляются). На данной среде может подавляться рост и некоторых сальмонелл, поэтому она не должна быть единственной селективной средой в ходе исследования. На висмут-сульфитном агаре подавляется рост шигелл и таких сальмонелл, как S.Sendai, S.Berta, S.Gallinarum, S.Abortus equi [17].

В состав ксилоза-лизин-дезоксихолатного агара входят: дрожжевой экстракт, L-лизин, лактоза, сахароза, ксилоза, натрия хлорид, натрия дезоксихолат, натрия тиосульфат, железа аммонийного цитрат, феноловый красный, агар-агар. Этот селективно-дифференциальный агар рекомендован Тэйлором для выделения и идентификации патогенных кишечных бактерий, в частности, шигелл, из фекалий. Дезоксихолат подавляет рост грамположительных бактерий. Ксилозу ферментируют почти все энтеробактерии, кроме шигелл, что позволяет отличать их от сальмонелл. Сальмонеллы ферментируют ксилозу, но одновременно декарбоксилируют лизин, что, ввиду возврата рН к щелочным значениям, может имитировать рост шигелл на данной среде. Однако, для предупреждения такой реакции у лизинположительных колиформных бактерий, в среду в избытке введены лактоза и сахароза. В результате их ферментации образуется кислота, препятствующая декарбоксилированию лизина непатогенными сероводородпродуцирующими бактериями. Феноловый красный – индикатор рН. Среда отлично подходит для скрининга проб со смешанной микрофлорой, содержащей патогенные кишечные бактерии, так как выделение сальмонелл и шигелл возможно даже при обильном росте сопутствующих микроорганизмов [17].

В состав среды Плоскирева входят ингибирующие вещества (желчные соли, бриллиантовый зеленый, йод), вследствие чего она должна полностью подавлять рост грамположительной флоры, значительно задерживать (первые 24 ч) рост эшерихий и другой сопутствующей микрофлоры, подавлять роение протея.

Дифференцирующие свойства агара Плоскирева основаны на изменении рН в кислую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые образуют колонии брусничного цвета (индикатор нейтральный красный). Лактозоотрицательные бактерии вырастают в виде бесцветных или слабоокрашенных колоний. Вегетирующие свойства среды недостаточны для роста некоторых сальмонелл (S. Cholerae-suis, S. Pullorum).

Колонии бактерий, сбраживающих лактозу, на среде Эндо приобретают интенсивно красный цвет с металлическим блеском. Бактерии, не сбраживающие лактозу, формируют бесцветные либо цвета окружающей среды колонии. В среде Эндо основной фуксин при соединении с сернистокислым натрием вследствие редуцирования обесцвечивается. При росте бактерий, разлагающих лактозу, промежуточный продукт (ацетальдегид), возникающий в результате окисления сахара, реагирует с сернистокислым натрием и фуксин вновь приобретает красный цвет.

В состав среды Левина входят пептон, агар-агар, калий фосфорнокислый. Патогенные бактерии — возбудители брюшного тифа, сальмонеллезов, дизентерии,— не разлагая лактозы, растут на среде Левина в виде мелких, круглых, прозрачных, чаще бесцветных колоний, иногда с розоватым или голубоватым оттенком в то время как кишечная палочка образует небольшие гладкие колонии темно-синего цвета [17].

В межобластной лаборатории  я делала пересевы на ВСА и XLD-агар. С помощью одноразовой петли производила посевы методом секторных посевов, чтобы получить изолированные колонии. Посевы инкубировала при 37±1°С в течение 24ч.

 

2.4. Учет роста на плотной элективной  среде. 

На ВСА Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium и многие другие обычно образуют черные колонии с металлическим блеском, окруженные зоной почернения в результате продукции сероводорода и восстановления сульфита до сульфида железа, имеющего черный цвет. Salmonella Paratyphi A образует светло-зеленые колонии.

На XLD-агаре колонии сальмонелл имеют черный центр и слегка прозрачную зону красноватого цвета, H₂S-отрицательные варианты сальмонелл образуют розовые колонии с темно-розовым центром, лактозоположительные – желтые колонии с почернением или без него [12].

Колонии бактерий, сбраживающих лактозу, на среде Эндо приобретают интенсивно красный цвет с зеленым металлическим блеском. Бактерии, не сбраживающие лактозу, формируют бесцветные либо цвета окружающей среды колонии.

Патогенные бактерии —  возбудители брюшного тифа, сальмонеллезов, дизентерии,— не разлагая лактозы, растут на среде Левина в виде мелких, круглых, прозрачных, чаще бесцветных колоний, иногда с розоватым или голубоватым оттенком в то время как кишечная палочка образует небольшие гладкие колонии темно-синего цвета.

 

2.5. Характеристика тестов для  дифференциации и идентификации  сальмонелл

После выделения культур, предположительно относящихся к  бактериям рода Salmonella, я проводила тесты для идентификации. Из отобранных колоний готовила мазки и окрашивала по Граму: грамотрицательные мелкие палочки с закругленными концами.

По две характерные  для сальмонелл колонии из каждой чашки Петри я пересеяла на 3х сахарный агар (также можно использовать среду Олькеницкого или агар Клигера) сначала штрихом по скошенной поверхности и, затем, уколом в столбик среды. Инкубировала при 37°С в течение 24ч. При росте типичных культур поверхность среды остается красной, столбик становится желтым с разрывами и пузырьками, сероводород образуется в 90% случаев.

Проводятся также следующие  биохимические и серологические тесты[12]:

• Способность расщепления мочевины определяют посевом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной. Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину и изменений цвета среды не будет;
• Образование L-лизиндекарбоксилазы проверяют на жидкой L-лизиндекарбоксилазной среде. Посевы инкубируют при 37°С 24±3ч.помутнение и пурпурный цвет среды указывает на положительную реакцию. Желтый цвет говорит об отрицательной реакции. Сальмонеллы, кроме S.Paratyphi A, образуют лизиндекарбоксилазу, в отличие от сходных с ними бактерий рода Citrobacter;

 

• Реакция Фогеса-Проскауэра (образование ацетоина). После инкубации посевов на среде Кларка или VP-среде при 37°С в течение 24ч в пробирку прибавляют две капли раствора креатина, три капли раствора альфа-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия, перемешивают содержимое пробирки после прибавления каждого реактива. Сальмонеллы не образуют ацетоин, поэтому розового окрашивания не образуется;

 

• Определение образования индола проводят после выращивания культуры на жидкой питательной среде, содержащей L-триптофан,  в течение 24ч при 37°С. После инкубирования к посевам в пробирки добавляют по каплям раствор реактива Эрлиха или Ковача. Сальмонеллы не образуют индол, поэтому образуется желто-коричневое кольцо;

 

• Определение β-галактозидазы. Суспендируют петлей культуру в 0,25 см³ физиологического раствора, прибавляют одну каплю толуола и встряхивают пробирку. Помещают пробирку в водяную баню при 37°С и оставляют на 5 минут. Затем добавляют 0,25 см³ реактива и перемешивают. Оставляют пробирку в водяной бане при 37°С в течение 24±3ч, наблюдая за изменением цвета каждые 10-20минут. Бактерии рода Salmonella, кроме S.Arizonae, не обладают β-галактозидазой, поэтому изменения цвета на желтый не будет [13];

 

• Ферментация сахарозы и маннита определяют на средах Гисса с этими сахарами. Сальмонеллы не ферментируют сахарозу, но ферментируют маннит;

 

• Определение подвижности. Культуры пересевают уколом в полужидкий питательный агар или полужидкий мясо-пептонный агар. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 24±3ч. При росте подвижных культур отмечается диффузионный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур – вокруг места укола. Бактерии рода Salmonella, кроме S.Pullorum и S.Gallinarum, подвижны.

 

Для установления принадлежности выделенных культур к роду Salmonella в микробиологической лаборатории отдела ВСЭ МОВЛ я устанавливала их ферметативные свойства. Обычно это делают с помощью сред короткого и длинного пестрых рядов:

1. Скошенный МПА – для изучения характера и частоты роста;
2. Мясо-пептонный бульон для установления образования сероводорода и индола;
3. Мясопептонная желатина – имеется ли разжижение;

Среды Гисса:

4. с лактозой,
5. с глюкозой,
6. с сахарозой,
7. с маннитом,

Учет ведут следующим  образом:

м/о	2		3	4	5	6	7
	H2S	Индол
Salmonella	+	-	±	-	+	-	+

 

8. с арабинозой,
9. с дульцитом,
10. с инозитом,
11. с рамнозой,
12. бульон Штерна,
13. с трегалозой,
14. с ксилозой.

Ферментация сахаров длинного пестрого ряда и других неоднозначна для разных штаммов, поэтому с помощью них можно биохимически установить серотип бактерии.

 

Таблица 3. Ферментативные свойства S.Typhisuis и S.Choleraesuis [11].

Субстрат	S.Typhisuis	S.Choleraesuis	S.Choleraesuis var.Kunzendorf
			1 вар.	2 вар.
Глюкоза	-	+	+	+
Лактоза	-	-	-	-
Маннит	-	+	+	+
Сахароза	-	-	-	-
Индол	-	-	-	-
Сероводород	-	-	+	+
Мочевина	-	-	-	-
Рамноза	+	+	+	+
Ксилоза	+	+	+	+
Мальтоза	(+)	+	+	+
Сорбит	-	+	+	+
Арабиноза	-	+	-	+
Дульцит	(+)	-	-	+
Инозит	-	-	-	+
Лизин	-	+	+	+

Реакция: - отрицательная,