Основні напрями сучасної біотехнології. Генетична та клітинна інженерія

 З матеріалів, представлених в цьому огляді, видно, що сучасні біотехнології виключно різноманітні. Наступаюче століття, на думку ряду експертів, буде століттям біотехнологій.

Генетична та клітинна інженерія

Генетична інженерія — це нова галузь молекулярної біології, яка розробляє метоли передавання генетичного матеріалу від одного живого організму до іншого з метою одержання нової генетичної інформації та управління спадковістю. Розвиток генетичної інженерії пов'язаний з досягненнями сучасної генетики, мікробіології й біохімії. Початок цієї галузі покладений П. Боргом (1972), який одержав перші гібридні (рекомбіновані) ДНК.

 У нас використовують два терміни—генетична інженерія й генна інженерія. Слід зазначити, що назву генетична інженерія використовують в більш широкому понятті, тобто вона включає й генну інженерію. При цьому до генної інженерії не відносять перебудову генома звичайними генетичними методами, тобто мутаціями, рекомбінаціями.

Розглянуто основні генноінженерні підходи, що можуть бути використані в тваринництві. Відомо, що генетичний матеріал всіх рослин, тварин, мікроорганізмів являє собою молекулу ДНК. Всі клітини організму мають ідентичні копії ДНК, але й ДНК диференціюється від організму до організму. Деякі організми представлені однією молекулою ДНК в своїй клітині (бактерії), а інші — більш ніж однією (гриби, рослини й тварини).

Кожна непорушена молекула ДНК називається хромосомою. У багатоклітинних організмів одна запліднена яйцеклітина дає початок  для створення величезної кількості  клітин. Отже, І кожна вихідна  молекула ДНК новоствореної зиготи е основою для виникнення гігантської  кількості нових, але однозначних  за зашифрованою генетичною інформацією  молекул ДНК.

Структуру ДНК  встановили у 1953 р. лауреати Нобелівської премії Д. Уотсон і Ф. Крік на основі рентгеноструктурного аналізу. Відповідно до їх моделі молекула ДНК має подвійну спіраль, що складається з двох антипаралельних нуклеотидних ланцюгів з загальною віссю.

Кожна молекула ДНК (хромосома) складається з окремих одиниць — генів, які несуть в собі інформацію, записану чотирма літерами коду. Цей код може бути зчитаний за допомогою клітинного механізму, що транслює так званий меседж (Інструкцію, вказівку) з кожного гена для синтезу одного конкретного протеїну. Протеїни являють собою молекули, необхідні для життя і виконання основних життєвих функцій, таких як ферментний каталіз біохімічних реакцій в клітинах і будівництво та структурний матеріал для клітин.

Основою проведення генноінженерних досліджень є молекула ДНК. При цьому роботи виконують в певній послідовності: спочатку виділяють гени з окремих клітин або синтезують їх поза організмом, потім включають нові гени у вектор, поєднують ДНК гена й вектора І одержують рекомбінантну ДНК; далі переносять визначені гени в геном клітини-хазяї-па, проводять копіювання й розмноження виділених або синтезованих генів у складі вектора (клонування генів) І одержують генний продукт шляхом експериментальної експресії чужорідного гена в реципієнтній клітині.

Відомо два  шляхи виділення генів та створення  рекомбінантної ДНК. Перший — за допомогою  хімічного синтезу (Корана, 1969), а  другий, більш поширений, грунтується  на використанні особливих ферментів (рестриктаз), які мають властивість розпізнавати чужорідну ДНК, що проникла в організм, і розщеплювати її в відповідних ділянках.

В результаті утворюються фрагменти різноманітних  розмірів, які різняться між собою  за довжиною. Відомо близько 500 ферментів  рестриктаз і кожний розщеплює ДНК  специфічно.  Хоча  багато  з  них  за  специфічністю подібні, проте кількість сайтів (ділянок) розщеплення  становить близько  120.  Зазначені ферменти   позбавлені   видової  специфічності. Завдяки  цьому можна поєднувати в одне ціле фрагменти ДНК будь-якого  походження й долати природні видові бар'єри.

Частини й  розриви ниток ДНК лігизують (склеюють) за допомогою ферменту лігази. Особливістю  виділених ділянок нуклеотидів (генів) є так звані липкі кінці, через  що їх можна приєднати до ділянок  ДНК плазмід (для рослин І бактерій) або фагів (тварини). Таким чином  створюється вектор для перенесення  виділених генів у клітину-реципієнт.

Відомо інший  шлях одержання фрагментів ДНІ< з  липкими кінцями. Для цього виділені або штучно синтезовані ділянки  ДНК обробляють ендонуклеазою, яка  укорочує її з обох боків. Потім за допомогою ферменту полінуклеотидтрансферазн добудовують до цих кінців ділянки  аденінових і тимідинових нуклеотидів. Одержану молекулу рекомбінантної ДНК  використовують для перенесення  чужорідного гена в бактеріальну клітину. Така схема була використана  для генів інсуліну, інтерферону, імуноглобуліну.

Молекули  ДНК, які мають власний апарат реплікації і здатні доставляти в  клітину потрібні гени й реплікувати  їх, були названі векторами. Найбільш поширені вектори — це різноманітні плазміди, які часто спостерігаються  у бактерій. Вектори для клітин ссавців будуються на основі вірусів, адено- та ретровірусів.

Потрібно  враховувати, Ідо наявність І  навіть введення гена у хромосому  організму-хазяїна ще не дає можливості одержати продукти його синтезу. Для  того, щоб ген міг функціонувати, він повинен поряд з частиною, де закодована інформація, мати ще регуляторну  ділянку. Це так звані промотор та термінатор. З промотора починається  зчитування інформації (транскрипція), а в термінаторі закодовано закінчення транскрипції з даного гена. Нині створено цілий «арсенал» клонованих промоторів, які дають можливість забезпечити проявлення генів у різних типах клітин.

Слід враховувати  також, що не всі молекули плазмІдної ДНК можуть мати вставки чужої  ДНК і відповідно не будуть рекомбінантними. Більшість плазмід відновлює  вихідну кільцеву структуру. Тому перш за все необхідно відібрати бактерії, що містять рекомбінантнІ плазміди.

Для відбору  рекомбінантних ДНК найбільш поширеною  е система, при якій чужорідну  ДНК вбудовують в частину плаз-мідного  гена, що кодує стійкість проти  певного антибіотика, наприклад, ампіциліну. У випадку вбудовування чужорідної ДНК цей ген перестає нормально  функціонувати, що свідчить про наявність  рекомбінантної ДНК.

Молекула  рекомбінантної плазміди розмножується  в клітині. У процесі ділення  бактеріальної клітини вони розподіляються між дочірніми клітинами і  в кожній з них знову відновлюють  свою кількість. У результаті створюються  колонії бактерій, кожна з яких містить багато копій рекомбінантної ДНК. У кожному такому клоні міститься  тільки один відрізок ДНК тварини  або рослини, який випадково потрапив у вихідну бактерію.

Клітинна інженерія - створення клітин нового типу на основі їх гібридизації, реконструкції і культивування. У вузькому значенні слова під цим терміном розуміють гібридизації протопластів або тваринних кліток, в широкому різні маніпуляції з ними, направлені на рішення наукових і практичних задач. Є одним з основних методів біотехнології.

Гібридизація соматичних клітин

  У основі методу лежить злиття клітин, внаслідок чого утворяться гетерокаріони, що містять ядра обох батьківських типів. Гетерокаріони, що утворилися дають початок двом одноядерним гібридним клітинам. У 1965 англійський вчений м. Харріс уперше отримав гетерокаріони, утворені клітинами миші і людини. Таку штучну гібридизації можна здійснювати між соматичними клітинами, що належать далеким в систематичному відношенні організмам і навіть між рослинними і тваринними клітинами. Гібридизація соматичних клітин тваринних зіграла важливу роль в дослідженні механізмів реактивації генома нерухомої клітини і ступеня фенотипового вияву (експресивності) окремих генів, клітинного розподілу, в картируванні генів в хромосомах людини, в аналізі причин злоякісного переродження клітин. За допомогою цього методу створені гібридоми, що використовуються для отримання моноклональних (однорідних) антитіл.

    Перший міжвидовий гібрид при злитті протопластів з клітин різних видів тютюну був отриманий в 1972 П. Карлсоном (США). Гібриди, отримані при злитті протопластів, мають важливі відмінності від статевих гібридів оскільки несуть цитоплазму обох батьків. Можливе створення цибридів, що успадковують ядерні гени одного з батьків нарівні з цитоплазматичними генами обох батьків. Особливий інтерес уявляють цибриди рослин, несучі цитоплазматичні гени стійкості до різним патогенам і стресорним чинникам від дикорослих видів або цитоплазматичні гени чоловічої стерильності. Злиття протопластів використовують також для отримання гібридів з цінними в господарському відношенні властивостями між віддаленими видами, які погано або взагалі не схрещуються звичним шляхом. Вдалося, наприклад, "ресинтезувати" рапс, що є природним амфідиплоїдом між турнепсом і капустою, отримати соматичний гібрид картоплі з томатами і т. д. При злитті протопластів створюють і нові клітинні лінії-продуценти важливих сполук.

    Реконструкція клітин

   Одним з способів модифікації клітин є введення в них індивідуальних генів, тобто метод генетичної інженерії. Вбудування активного гена на місце відсутнього або пошкодженого відкриває шлях для лікування генетичних захворювань людини. Змінювати властивості кліток можна, вводячи клітинні органели (ядра, хлоропласти), ізольовані з одних клітин, в протопласти інших клітин. Так, одним з шляхів активізації фотосинтезу рослинної клітини може служити введення в неї високоефективних хлоропластів. Штучні асоціації рослинних клітин з мікроорганізмами використовують для моделювання на клітинному рівні природних симбіотичних відносин, що грають важливу роль в забезпеченні рослин азотним живленням в природних екосистемах. Розглядається можливість придання рослинам здібності до фіксації молекулярного азоту при введенні в них цілих клітин нітрогенофіксующих мікроорганізмів. Реконструкцію клітин проводять також при злитті клітинних фрагментів (без'ядерних, кариопластів з ядром, мікроклітин, що містять лише частину генома інтактної клітини) один з одним або з інтактними (непошкодженими) клітинами. У результаті отримують клітини з різними властивостями, наприклад, цибриди, або клітини з ядром і цитоплазмою від різних батьків. Такі конструкції використовують для вивчення впливи цитоплазми в регулюванні активності ядра.

 

 Поліпшення  рослин і тварин на основі  клітинних технологій

 Клітини, що вирощуються на штучних поживних середовищах і тканини рослин складають основу різноманітних технологій в сільському господарстві. Одні з них направлені на отримання ідентичних вихідній формі рослин (оздоровлення і клональне мікророзмноження, створення штучного сім'я, кріозберігання генофонду при глибокому заморожуванні меристем і клітин пилка). Інші на створення рослин, генетично відмінних від вихідних, шляхом або полегшення і прискорення традиційного селекційного процесу або створення генетичної різноманітності і пошуку і відбору генотипів з цінними ознаками. У першому випадку використовують штучне запліднення, культуру незрілих гібридних сім'япуп'янок і зародки, регенерацію рослин з тканин летальних гібридів, гаплоїдні рослини, отримані при культивуванні пильовиків або мікроспор. У другому нові форми рослин створюються на основі мутантів, що утворюються in vitro, і трансгенних рослин. Таким шляхом отримані рослини, стійкі до вірусів і іншим патогенам, гербіцидам, рослини, здатні синтезувати токсини, патогенні для комах-шкідників, рослини з чужерідними генами, контролюючими синтез білків холодостійкості і білків з поліпшеним амінокислотним складом, рослини із зміненим балансом фітогормонів і т.д.

 Важливу  роль в тваринництві зіграла  розробка методів тривалого зберігання  сперми в замороженому стані  і штучного запліднення. Реально  ж розвернулися дослідження по  клітинній і генній інженерії  на ссавцях тільки з освоєнням  техніки запліднення in vitro, що  забезпечила отримання достатньої  кількості зародків на ранніх  стадіях розвитку. Генетичне поліпшення  тварин пов'язане з розробкою  технології трансплантації ембріонів  і методів мікроманіпуляцій з  ними (отримання однояйцевих близнюків,  міжвидові пересадки ембріонів  і отримання химерных тварин, клонування тварин при пересадці  ядер ембріональних кліток в  енуклійовані, т. е. з видаленим  ядром, яйцеклітини). У 1996 шотландським вченим з Едінбурга уперше вдалося отримати вівцю з енуклійованої яйцеклітини, в яку було пересаджене ядро соматичної клітки (вимені) дорослої тварини. Ця робота відкриває широкі перспективи в області клонування тварин і принципову можливість клонування в майбутньому і людини. У цій же лабораторії було отримано ще п'ять клонованих ягнят, в геном одного з яких був вбудований ген білка людини.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список  використаної літератури: 
"Мир Науки и Культуры" Основные направления развития современных биотехнологий. Сергей Алексеевич Писаржевский.

“Клітинна інженерія”   Липень 11, 2011 · Біологія

В.П. Коваленко, І.Ю. Горбатенко. Біотехнологія у тваринництві й генетиці. Київ "Урожай", 1992р.