Конструирование рекомбинантной плазмиды, содержащей ген гликопротеина вируса гриппа птиц

КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ПЛАЗМИДНОГО ВЕКТОРА pTKP7.5/HA, НЕСУЩЕГО ВСТАВКУ ГЕНА ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПА Н5N1

     ¹Елаткин Н.П., аспирант; ²Власова Н.Н., д.б.н; ¹Андрейчук Д.Б., к.б.н.; ²Казакова А.С., аспирант

1 - ФГУ  Федеральный Центр Охраны Здоровья Животных (ФГУ «ВНИИЗЖ»), г.Владимир

2 - Всероссийский  НИИ ветеринарной вирусологии  и микробиологии, г. Покров 

     Введение

     Грипп – это острое контагиозное заболевание  животных, птиц и людей, вызываемое вирусами из семейства Orthomyxoviridae. Вирусы гриппа А, поражающие домашнюю птицу, могут быть разделены по их способности вызывать заболевание на высокопатогенный грипп птиц и низкопатогенный грипп птиц [5].

     Высокопатогенный  грипп птиц (ВПГП) – крайне контагиозная, пантропная системная болезнь птиц с высокой смертностью (до 100%), которая вызывается подтипами Н5 и Н7 вируса гриппа А, поражает домашнюю, дикую, синантропную птицу и наносит огромный ущерб птицеводству во всём мире, а также опасна для человека.

     Важной  задачей в борьбе с гриппом  птиц является разработка высокоэффективных, безопасных, недорогих и технологичных вакцин. Одними из самых перспективных вакцин для борьбы с инфекционными заболеваниями в данное время являются генно-инженерные вакцины [2].

     Широко рапространенными векторами для создания генно-инженерных рекомбинантных вакцин являются поксвирусы. В качестве модели экспрессирующей системы активно применяется вирус осповакцины, который с большим успехом был использован при создании генно-инженерных вакцин против многих заболеваний [1].

     Важной  практической задачей для создания рекомбинантных вакцин является конструирование  плазмидных векторов, несущих вставки иммуногенных генов вируса гриппа птиц. Эти векторы могут применяться для создания вакцин, получения рекомбинантных белков, а также в качестве безопасного и эффективного количественного положительного контроля для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в режиме реального времени (ПЦР РВ). Одним из белков вируса гриппа птиц, обладающим наибольшей иммуногенностью и формирующим протективный типоспецифичный иммунитет является гемагглютинин, который в составе вакцин вызывает, практически, 100 процентную защиту и всё чаще применяется для создания рекомбинантных вакцин [3].

     Целью работы было конструирование рекомбинантной плазмиды, несущей последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа птиц, что является необходимым условием для создания генно-инженерных вакцины на основе вируса осповакцины.

      Материалы и методы

     В качестве вектора для клонирования была использована малокопийная плазмида pTКР7.5, несущая в своей последовательности ранне-поздний промотор белка вируса осповакцины молекулярной массой 7.5 кДа (промотор 7.5) («Вектор», Новосибирск), в качестве носителя конструкции – компетентные клетки авирулентного штамма E.coli НВ101 («Promega», США). Промотор и полилинкерный участок плазмиды фланкирован последовательностями гена тимидинкиназы вируса осповакцины (Рис. 1).

Рис.1 Схема плазмидного  вектора pTKP 7.5 и pTKP 7.5/НА

     Для постановки обратной транскртпции (ОТ) использовали AMV-ревертазу фирмы «Promega» (США), гексамерные случайные праймеры («Fermentas», Литва), для постановки ПЦР Pfu-полимеразу («Fermentas», Литва). Реакции проводили в амплификаторе BioRad PTC-220 (США).

     Расчет  праймеров для наработки кДНК гена гемагглютинина (HA) производили по последовательности гена ВПГП штамма A/duck/Novosibirsk/02/2005 (H5N1) с использованием программы OLIGO 6.2 исходя из первичной последовательности гена, опубликованной в базе данных GeneBank. Размер ПЦР-ампликона, содержащего полноразмерный ген – 2117 п.о. В структуру праймеров были включены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и PaeI (SphI) для последующего лигирования с вектором.

Таблица 1

Праймеры для амплификации кДНК полного гена гемагглютинина

вируса  гриппа птиц подтипа H5

     В работе использовали общепринятые методы культивирования бактерий, выделения  нуклеиновых кислот, а также ряд  молекулярно-биологических методов (ОТ-ПЦР, клонирование в прокариотическом векторе) [4] с применением следующих ферментов: T4 DNA лигаза (активность 10 е.а./мкл) («Fermentas», Литва), эндонуклеазы рестрикции PaeI и BamHI («Fermentas», Литва).

     Результаты  и их обсуждение

     Для увеличения эффективности ОТ-ПЦР и снижения вероятности неспецифического синтеза, была проведена оптимизацию ОТ-ПЦР.

     Был введён этап лигирования после обратной транскрипции, увеличивший выход специфического ПЦР продукта. Для снижения частоты ошибок в процессе амплификации, использовали Pfu-полимеразу, частота встраивания некомплементарных нуклеотидов у которой 2,3х10^-6 [1], что значительно ниже, чем у Taq-ДНК-полимеразы. Использование в ПЦР Pfu полимеразы также позволило повысить выход специфического продукта. Оптимизацию параметров цикла амплификации проводили по температурному и временному профилю реакции. Температура отжига была установлена – +58^оС, время элонгации – 3 мин.

       В процессе оптимизации нам удалось увеличить выход специфического продукта длинной 2117 п.о. с 10мкг/мл до 50мкг/мл (в очищенной пробе) и наработать кДНК гена гемагглютинина в количестве, достаточном для клонирования (Рис. 2).

                      1                         М         1             2           3

      А.             Б.                      

                                кДНК гена гемагглютинина ВГП  Н5

     Рис 2. Электрофореграмма результатов ПЦР с клонировачными праймерами для наработки полноразмерного гена гемагглютинина

     (М – маркер молекулярной массы Gene Ruler 100bp DNA Ladder Plus (Fermentas); А1 – до оптимизации ПЦР; Б 1-3 – после оптимизации ПЦР) 

     На  следующем этапе работы осуществляли встройку кДНК гена гемагглютинина в плазмиду pTKP 7.5. Для этого рестрицировали плазмиду эндонуклеазами BamHI и PaeI (SphI), затем осуществляли лигирование по липким концам с обработанной этими же рестриктазами кДНК гена НА. После этого провели трансформацию клеток E.coli  штамма НВ101 полученной лигазной смесью.

     На  заключительном этапе мы провели  скрининг полученных клонов. Для этого мы отобрали три полученных клона, подрастили их на питательной среде и выделили плазмиду. Скрининг проводили по электрофоретической подвижности плазмиды, несущей вставку гена по сравнению с нерекомбинантной плазмидой; методом гнездовой ПЦР с использованием праймеров разработанных сотрудниками лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ»; методом рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и PaeI. Результаты скрининга клонов отраженны в таблице 2.

     Таблица 2

     Результат скрининга клонов трансформантов

     Таким образом, в результате работы были получены два клона плазмид pTKP7.5/HA, несущих последовательность полноразмерного гена гемагглютинина вируса высокопатогенного гриппа птиц подтипа Н5N1. Была проведена проверка наличия и корректность вставки целевого гена. Данные плазмиды могут использоваться для дальнейших работ по получению рекомбинантной вакцины на основе вируса осповакцины.

     Список литературы

1. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Новосибирск, 2004. 496 с.

2. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Highly pathogenic avian influenza (O.I.E.). Paris, 2004. V. 1. P. 258 – 269.

3. Mingxiao Ma, Nigyi Jin, Zhenguo Wan, Ruilin Wang. Construction and immunogenicity of recombinant fowlpox vaccines coexpressing HA of AIV H5N1 and chicken IL18 // Vaccine. 2004. V. 24. P. 4304 – 4311.

4. Molecular Cloning. A laboratory Manual/ T. Maniatis, E.F. Fritsch, S. Sambrooks// Cold Spring Harbor Laboratory. – Cold Spring Harbor, New York, 2006.

5. Swayne D. E., Perdue M. L., Garcia M., Rivera-Cruz E., et. al. Pathogenicity and diagnosis of H5N2 Mexican avian influenza viruses in chickens // Аvian Dis. 1997. V. 41 № 2. P. 335 – 346.