Физиология вирусов

      Торможение  цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым антителам.

      Прямая  иммунофлюоресценция. Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 недель, а при использовании меченых моноклональных антител идентификация возможна уже через 24 часа. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать не связавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).

      Иммуноэлектронная микроскопия позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами антитела, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.

      Более простой и доступный подход - выявление противовирусных антител в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2-3 недели. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление антител с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти антитела циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период реконвалесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра анител, выявленное при исследовании второй пробы.

      Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать антитела, образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров антител в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую - в период выздоровления (через 2-3 недели). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.

      РТГА  выявляет антитела, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные антитела в сыворотке больного.

      РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций. Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.

        РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов антител, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с антителами, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.

      Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления антител известный антиген сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации не связавшиеся антитела удаляют, вносят антисыворотку к lg человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных антител и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических антител, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наибольшее распространение нашёл метод иммуноблотинга.

      Выявление вирусных антигенов

      ИФА. В настоящее время появились коммерческие наборы для выявления антигенов некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 минут. Для выявления антигенов на твёрдой фазе сорбируют известные антитела и добавляют сыворотку, содержащую антигены; после инкубирования несвязанный антиген декантируют, систему промывают и вносят меченые антитела, специфичные к сорбированным антителам. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

      Гибридизация  ДНК - высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра  применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ.  Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпштейн-Барра и др.

      ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

      Диагностика необходима  в целях идентификации микроорганизмов при установлении диагноза инфекционных заболеваний или иных вызванных микробами процессов и определения физиологических свойств  культуры с другими целями, например при выборе химиотерапевтического препарата. Пока не существует универсального метода для быстрого и качественного определения микроорганизма. Каждый метод подходит для определённого ряда инфекций и не годиться для определения возбудителей других заболеваний. В мире постоянно появляются или обнаруживаются новые неизвестные микроорганизмы и, возможно, от скорости их идентификации будет зависеть жизнь многих людей.  
 

Литература

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология - М., 1994;
2. Гурина С.В., Соколова И.П. Микробиология - СПб., 2000;
3. Жданов В.М., Гайдамович С.Я. Общая и частная вирусология - М.: Медицина, 1982;
4. Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь-справочник - Минск, 1999;.
5. Поздеев О.К. Медицинская микробиология – М., 2002;.
6. Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии - Ростов-на-Дону, 2002.
7. www.curemed.ru
8. www.dissforall.com
9. www.krugosvet.ru