Биосенсоры. Их настоящее и будущее

Этанольный сенсор включает иммобилизованные Trichosporon brassicae и кислородный электрод. Способ иммобилизации клеток и конструкция электрода такие же, как в глюкозном сенсоре.

Для измерений этим сенсором в стационарных условиях требуется много времени, поэтому был использован импульсный метод, обеспечивающий отклик в течение  всего 6 мин. Линейная зависимость между  уменьшением тока и концентрацией  этанола наблюдается в диапазоне  концентраций от 2 до 22,5 мг/л. Для пробы  с концентрацией этанола 16,5 мг/л  разностный токовый сигнал воспроизводим  с относительной погрешностью 6%. Стандартное отклонение составило 0,5 мг/л при числе опытов, равном 40.

Сенсор не проявляет чувствительности ни к летучим соединениям, таким, как метанол, муравьиная, уксусная и пропионовая кислоты, ни к нелетучим веществам.

Микробный этанольный сенсор использовали в дрожжевых бродильных средах. Определение концентрации этанола в тех же пробах методом газовой хроматографии дало результаты, сравнимые с полученными при помощи микробного сенсора: коэффициент корреляции составил 0,98 при числе опытов более 20. В диапазоне концентраций этанола 5,5-22,3 мг/л выходной ток сенсора оставался постоянным более трех недель, в течение которых было проведено 2100 анализов. Сейчас этот сенсор выпускается в Японии серийно.

Цефалоспориновый сенсор

 

Антибиотики обычно определяют с помощью  турбидиметрического или титриметрического микробиологического анализа, однако методики такого определения довольно сложны и непригодны для экспрессных анализов.

Известно, что Citrobac'ter freundii вырабатывает фермент цефалоспориназу, который катализирует реакцию цефалоспорина с выделением протона:

 

 

Цефалоспориназа, однако, очень неустойчива и не подходит для изготовления ферментного сенсора. В сенсоре, чувствительном к цефалоспорину, можно использовать целые клетки Citrobacter freundii, которые иммобилизуют в коллагеновой мембране, помещаемой затем в мембранный реактор.

На рис.2.8 показана система для  непрерывного определения цефалоспоринов. Она включает реактор мембранного типа с прокладкой в середине. Измерения рН, обусловливаемые ферментативной реакцией, измеряли комбинированным стеклянным электродом и регистрировали с помощью самописца.

При введении в реактор растворов, содержащих различные количества цефалоспоринов, разность потенциалов на электродах постепенно увеличивалась, пока не достигала некоторого максимума. Минимальное время отклика системы зависело от скорости потока и активности иммобилизованных бактерий в коллагеновой мембране.

 

 

При скорости потока 2 мл/мин максимальная разность потенциалов достигалась  через 10 мин.

Получена линейная зависимость  между максимальной разностью потенциалов  и логарифмом концентрации цефалоспорина. С помощью цефалоспоринового раствора определяли 7-фенилацетиламидодезацетоксиспорановую кислоту (7-фенилацетил-ADCA), цефалоридин, цефалотин и цефалоспорин С.

Стабильность микробного сенсора  проверяли, анализируя раствор, содержащий 125 мкг/мл 7-фснилацетил-АОСА. Цефалоспорин определяли несколько раз в день, однако наблюдаемая разность потенциалов не менялась в течение недели.

Эту систему применяли также  для определения цефалоспорина С в культуральной среде Cephalosporium acremonium. Результаты измерений сравнивали с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В случае микробного сенсора относительная погрешность составила 8%, следовательно, сенсор вполне пригоден для непрерывного определения цефалоспоринов в ферментационных средах.

Сенсор БПК

 

Биохимическое потребление кислорода (БПК) - один из часто используемых показателей  загрязнения органическими веществами. Обычно определение БПК требует  пятидневной инкубации, поэтому  необходим экспрессный метод  оценки БПК, дающий более воспроизводимые  результаты.

Насыщенный кислородом фосфатный  буферный раствор (0,01 М, рН 7) пропускали через проточную ячейку со скоростью 1 мл/мин. Когда измеряемый ток достигал стационарного значения, в ячейку вводили пробу со скоростью 0,2 мл/мин. Значение стационарного тока зависело от БПК анализируемого раствора. Затем ток постепенно возвращался к начальному уровню. Время отклика сенсора (время, требуемое для достижения стационарного тока) зависело от природы анализируемого раствора.

Линейная зависимость между  разностью токов (начального и стационарного  значений) и БПК, определяемого после  пятидневной выдержки в стандартном  растворе глюкозы и глутамината, наблюдалась до значения БПК 60 мг/л. Нижняя граница определяемых концентраций составляла 3 мг/л. При анализе раствора с БПК, равным 40 мг/л, ток воспроизводился с относительной погрешностью +6% (число опытов более 10).

Рассматриваемый микробный сенсор применяли для оценки пятидневного БПК необработанных сточных вод  бродильного производства. Пятидневное БПК сточных вод определяли также методом JIS (метод, рекомендованный Japanese Industrial Standard Committee). Значения БПК, оцененные микробным сенсором и определенные методом JIS, хорошо коррелировали между собой. С помощью данного сенсора оценивали также БПК необработанных промышленных сточных вод различных типов. Найдено, что сигнал сенсора определяется соединениями, присутствующими в сточных водах.

Основные биосенсоры на основе растительных и животных тканей

 

Тканевые материалы растительного  и животного происхождения успешно  используют в качестве биокаталитических компонентов биосенсоров. Биокаталитические материалы этого класса просто создают естественное окружение для представляющего интерес фермента, в результате чего требуемая ферментативная активность заметно стабилизируется. Во многих случаях тканевые биосенсоры служат намного дольше, чем аналогичные биосенсоры с выделенными ферментами. Кроме того, тканевые материалы сохраняют достаточно высокую специфическую активность, необходимую для конструирования некоторых биосенсоров, тогда как выделенные ферменты в тех же условиях разрушаются. В большинстве случаев эти преимущества достигаются не в ущерб избирательности. Если же в тканевом материале протекают мешающие процессы, разрабатывают специальные меры по увеличению избирательности. В этой главе достоинства тканевых биосенсоров показаны на конкретных примерах. Рассмотрено также несколько биосенсоров на основе таких биокаталитических материалов, как фрагменты животных клеток. Наконец, впервые предложены возможные механизмы транспорта (вход, внутренний перенос и выход) субстрата и продуктов в иммобилизованных клетках ткани.

Исторически тканевые биосенсоры появились позже рассмотренных в предыдущих главах ферментных и микробных биосенсоров. Возможность использования цельного фрагмента ткани млекопитающих в качестве биокаталитического слоя впервые была продемонстрирована на примере аргининового сенсора. Тонкий слой бычьей печени и соответствующее количество фермента - уреазы совместно иммобилизовали на поверхности аммиачного газочувствительного датчика. На кончике сенсора протекали каталитические реакции. 

 

Разработка этого первого сенсора  на основе ткани печени быка открыла  путь к созданию тканевых биосенсоров.

 Биосенсор АМР

 

Тканевые материалы не только удлиняют срок службы биосенсора, но и обеспечивают большую концентрацию заданного биокатализатора. Примером может служить рассматриваемый в этом разделе биосенсор AMP с газоаммиачным датчиком. Ограниченная площадь поверхности датчика не позволяет иммобилизовать большие количества ферментного препарата. Поэтому если специфическая активность последнего невысока, то и аналитические характеристики сенсора будут неудовлетворительными. Эффект низкой концентрации фермента проявился, в частности, в случае ферментного АМР-электрода, описанного в работе. Используемый в этом сенсоре выделенный фермент обычно имеет низкую активность, что приводит к малой величине наклона градуировочных кривых и короткому сроку службы. Чувствительность и срок службы сенсора AMP можно значительно улучшить при помощи тонкого слоя мышечной ткани кролика. Повышение чувствительности биосенсора непосредственно связано с пятикратным увеличением активности биокатализатора на поверхности датчика.

Выделенный фермент иммобилизуют на поверхности датчика с помощью  диацетилцеллюлозной мембраны. В тканевом биосенсоре тонкий слой мышечной ткани кролика удерживают на датчике найлоновой сеткой с отверстиями размером 37 мкм. Сенсоры обоих типов хранят при комнатной температуре в рабочем буферном растворе, содержащем 0,1 М ТрисНС1, 0,1 М КС1 и 0,02% азида натрия (рН 7,5). После сборки тканевый биосенсор следует выдерживать от 2 до 4 ч для удаления фонового аммиака.

Чтобы улучшить аналитический сигнал тканевого АМР-сенсора, оптимизировали различные параметры эксперимента (рН, концентрацию ионов калия, температуру и толщину слоя ткани). Найденные оптимальные условия-рН 7,5, 0,1 М К+ и 25°С. Увеличение толщины ткани приводит к большим временам отклика, которые становятся неприемлемыми при толщине слоя больше 0,81 мм. С другой стороны, кусочки ткани толщиной меньше 0,5 мм неудобны в обращении и плохо воспроизводимы. По этим причинам для изготовления сенсора используют слои ткани толщиной от 0,5 до 0,8 мм, которые можно легко получить с помощью острого лезвия бритвы.

Слой мышечной ткани кролика  толщиной 0,5 мм содержит приблизительно пять международных единиц АМР-деаминазной активности. В то же время сравнимый объем (25 мкм) коммерческого препарата фермента имеет активность всего 0,1 ед. Такая низкая активность и приводит к плохой чувствительности ферментных биосенсоров. Фактически перед иммобилизацией выделенный фермент приходится концентрировать фильтрацией в течение 16 ч и в результате активность ферментного слоя на поверхности электрода повышается до 0,9 ед. [35]. Но даже после такого концентрирования ферментативная активность в слое ткани остается выше примерно в пять раз. Часто бывает трудно найти надежный источник приобретения некоторых видов млекопитающих для получения специфического тканевого материала. В таких случаях в качестве биокатализатора удобнее использовать порошок из высушенной ацетоном ткани. Первая попытка такого рода описана в сообщении о биосенсоре AMP, в котором пасту из растертой в порошок обезвоженной ацетоном мышцы кролика физически закрепляли на поверхности аммиачного датчика [4].

Пасту из растертой в порошок  мышцы кролика получают следующим  образом. В пластиковую пробирку (1 мл) вводят 300 мкл буферного раствора, содержащего 0,1 М Трис-НС1, 0,1 М КО и 0,02% азида натрия (рН 7,9), и добавляют 100 мг замороженного порошка. Смесь перемешивают на вихревой мешалке в течение 30 с. При такой обработке получается однородная паста, необходимое количество которой (обычно 10 мг) наносят на тефлоновую мембрану аммиачного датчика. Поверх пасты помещают диацетилцеллюлозную мембрану и завинчивают колпачок электрода до положения, при котором паста прочно удерживается на месте. Собранный биосенсор оставляют вымачиваться на ночь в указанном выше буферном растворе для удаления фонового аммиака из биокаталитического слоя.

 Биосенсор мочевины

 

Здесь описан биосенсор для определения мочевины, а котором в качестве биокаталитического компонента используют слой муки из бобов канавалии мечевидной. Эта мука исходно содержит большое количество фермента уреазы, который катализирует реакцию

 

 

Этот биокаталитический материал оказался удачным заменителем чистого фермента.

Рассматриваемый биосенсор готовят следующим образом. С целого боба канавалии мечевидной удаляют наружный слой и измельчают семя с помощью ступки и пестика. Свежеприготовленную муку (обычно 7 мг) наносят на поверхность газоаммиачного датчика и смешивают с небольшим объемом буферного раствора (0,2 М Трис-HCl, рН 8,5, 0,1 мМ ЭДТА). Полученную таким способом пасту равномерно размазывают по мембране датчика и добавляют глутаровый альдегид, чтобы связать белки. В результате получается стабильный биокаталитический слой. Градуировочные кривые обычно получают в буферном растворе, содержащем Трис-HCl и ЭДТА при 25°С. Биосенсоры хранят в том же растворе при комнатной температуре.

Как видно из табл.3.7, основные характеристики мочевинного сенсора на основе бобовой  муки лучше, чем у сенсора на основе выделенного фермента. Более того найдено, что как катализатор  бобовая мука проявляет ярко выраженную селективность по отношению к  мочевине в присутствии разнообразных  веществ, которые потенциально могли  бы мешать определению. Преимуществами бобовой муки по сравнению с ферментом  являются также низкая стоимость  и более удобные условия хранения. Очищенная уреаза относительно дорога и должна храниться при температуре замерзания или более низкой, тогда как бобовая мука существенно дешевле и неплохо сохраняется при комнатной температуре. Таким образом, при конструировании биосенсоров мочевины мука из бобов канавалии мечевидной является хорошей заменой очищенной уреазы.

Цистейповый биосенсор

 

Для конструирования биосенсоров можно эффективно использовать и другие виды растительных материалов. Например, для определения цистеина на поверхности аммонийного датчика иммобилизуют модифицированные листья огурца. Вообще листья растений, по-видимому, имеют много преимуществ как биокатализаторы благодаря своему строению. Многие листья имеют многослойную структуру, включающую восковое покрытие (кутикулу) с внешней стороны листа, слой эпидермальных клеток (эпидермис) и примыкающий к нему губчатый промежуточный слой; те же слои повторяются в обратном порядке на другой стороне листа. Кутикула обладает гидрофобными свойствами, однако проницаема для газов. Газообмен осуществляется через небольшие отверстия на поверхности листа, называемые устьицами. Губчатый промежуточный слой наиболее активен в метаболических процессах с участием газов. Для получения биокаталитических мембранных электродов срезают кутикулу с наружной или нижней стороны листа и помещают оставшуюся часть листа на газочувствительный потенциометрический электрод так, чтобы открытый эпидермальный слой находился в контакте с анализируемым раствором, а газопроницаемая восковая кутикула-с внутренними элементами сенсора.