Биосенсоры. Их настоящее и будущее

глюкозном биосенсоре на противоположную, то есть  платиновый  катод сделать

анодом, то при  потенциале  +0,6В он становится  совершенно  нечувствительным

к кислороду, но зато дает отклик на пероксид водорода,  который при данном

значении потенциала окисляется до воды. Чувствительность такого электрода к

пероксиду водорода оказалась привлекательной, а поскольку вода  образуется

как продукт  ферментативной реакции, по его содержанию можно сделать вывод  о

концентрации,  например  глюкозы  в  различных   объектах.   Другой   способ

улучшения  селективности  биосенсоров  и устранения  помех от  посторонних

примесей   состоит   в   использовании   различных   мембран    -    пленок,

предотвращающих их попадание  непосредственно  на  электрод-преобразователь.

При этом  внутренняя  мембрана  выполняет  функцию  защиты  от  примесей,  а

внешняя мембрана пропускает субстрат в биослой. Однако необходимо  отметить,

что с  помощью  специальных  приемов,  называемых  химической  модификацией,

можно до такой  степени  изменить  свойства  поверхности  электрода,  что  он

будет  "глухим"  к  большинству  примесей  и,  напротив,  чувствительным   к

компонентам ферментативной реакции.

      Биосенсоры,  основанные  на  кислородном электроде   как   физическом

трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов:  кроме

глюкозы - лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты,  то  есть

анионы  соответствующих  карбоновых  кислот.  В  литературе  описаны  другие

биосенсоры подобного типа, ряд которых применяется на практике.

      С помощью биосенсоров можно решить и обратную  задачу:  при  некоторой

определенной  концентрации   субстрата   оценивать   активность   собственно

фермента  по величине измеряемого сигнала    ( потенциала, тока и т. д.).  Из

описания  работы фермента следует, что измеряемый сигнал  зависит  не  только

от концентрации субстрата, но и от каталитической активности  биологического

преобразователя,  то  есть   фермента.   Такое   использование   биосенсоров

позволяет измерить активность большого числа ферментов,  например  в  крови.

Оценка активности ферментов, связанных  с  сердечной  деятельностью,  таких,

как  аспартамаминотрансфераза,  креатинкиназа,   позволяет   в   клинических

условиях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности  фермента

амилазы используются в педиатрии.

 

 

                  Биосенсоры на основе других биоматериалов

 

 

      Многие ферменты дороги и быстро  теряют свою активность,  использование

выполненных  на  их  основе   биосенсоров   не   может   быть   экономически

целесообразным.   Поэтому    применение    бактерий,    микроорганизмов    и

биологических  тканей  различного   происхождения   более   предпочтительно,

поскольку  в  данном  случае  отпадает   необходимость   в   предварительном

получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам таких  биосенсоров

можно отнести  низкую селективность определения  вследствие того,  что  клетки

живых  организмов  фактически  являются   источником   самых   разнообразных

ферментов. Помимо  этого  время  отклика  биосенсоров  на  основе  тканей  и

микроорганизмов может  быть  достаточно  большим,  что  также  уменьшает  их

практическую  ценность.  Тем  не  менее  в   последнее   время   наблюдается

повышенный  интерес к разработке конструкций  электродов, содержащих  не  сами

ферменты  в очищенном виде,  а  их  первозданные  источники  -  биологические

материалы. Так, было установлено, что тканевые  срезы  в  биосенсорах  могут

выполнять функцию  источников  каталитической  активности.  Например,  создан

биосенсор на аскорбиновую кислоту,  состоящий  из  платинового электрода и

пластины  кожуры огурца  или  тыквы,  служащей  источником  аскорбиноксидазы.

Активность  фермента в такой природной матрице  достаточна для проведения  50-

80 определений  аскорбиновой кислоты в различных  объектах.  Установлено,  что

пластины  биоматериала могут храниться без  потери активности в  течение  года

в 50%-ном глицерине.

      Аналогичный подход использовали  при создании конструкции биосенсора на

допамин - важнейший биогенный амин,  участвующий в регуляции деятельности

мозга. В  данном  биосенсоре  ткань плода банана  была  иммобилизована  на

поверхности кислородного электрода.  В  рассмотренных  случаях  биоматериалы

создают "естественное окружение" для ферментов, способствующее  стабилизации

их  активности.  Тканевые  материалы  достаточно  долго  сохраняют   высокую

специфичность,  что  очень  важно  для  биосенсора,  тогда как   выделенные

ферменты  в тех  же  условиях  быстро  разрушаются.  Известны  биосенсоры,  в

которых  использован цельный фрагмент  ткани   печени   быка,   являющийся

носителем фермента каталазы и  иммобилизованный  на  кислородном электроде.

Ферментативное  действие  каталазы,   проявляющееся   в   катализе   реакции

разложения  пероксида  водорода,  используют  в этом  случае  для создания

соответствующего  электрода. Разработан биосенсор на  основе  кожуры  кабачка

или огурца и кислородного электрода для  определения  L-аскорбиновой  кислоты

во фруктовых  соках, функционирующий  подобно аналогичному  типу  электрода,

уже рассмотренного выше.  Тем  не  менее,  несмотря  на  успехи  в  развитии

биосенсоров   на   основе   биологических    материалов,    надежность    их

функционирования  все еще  остается  спорной.  Еще  один  пример  конструкции

биосенсорного  устройства  относится к ферментному электроду на   основе

микроорганизмов - дрожжей,  помещаемых  между  двумя  пористыми  мембранами.

Биосенсор  на  основе  иммобилизованных  дрожжей и кислородного  электрода

позволяет определять этанол и метанол, например в промышленных стоках.

      Интерес представляют биосенсоры на основе иммобилизованных на мембране

микроорганизмов, служащих элементом так называемого микробного  сенсора.  В

качестве примера таких устройств можно упомянуть амперометрический сенсор

на аммиак (в  сточных  водах)  на  основе  иммобилизованных  нитрифицирующих

бактерий  и кислородного  электрода.  Такой  биосенсор  полезен при решении

вопросов  охраны  окружающей  среды,  и  в  частности  при  контроле  степени

очистки промышленных стоков.

      Можно отметить также использование  биосенсоров на  основе  гидролаз  -

ферментов,   являющихся    катализаторами    гидролитического    расщепления

субстратов.  Эти  биосенсоры  предназначаются,  как правило,  для эколого-

аналитического   контроля    остаточных    количеств    пестицидов    класса

фосфорорганических  соединений, а также для определения  некоторых  ОВ.  Если

при гидролизе  какого-либо субстрата  ферментом  класса  гидролаз  образуется

электрохимически   активное   соединение,   то,    контролируя    содержание

последнего, можно  контролировать  ферментативную  реакцию  так  же,  как  в

предыдущих  случаях. Однако в присутствии веществ,  являющихся  ингибиторами,

активность  фермента  уменьшается,  что   и   обнаруживается   по   сигналу,

регистрируемому  электродом.  Интересно отметить  высокую чувствительность

такого  определения:  эффект  изменения  активности  фермента  доступен  для

измерения уже  при действии ультраследовых количеств ингибитора -  на  уровне

пико- и фемтограмм.

 

Сенсор для определения  усваиваемых сахаров

 

При культивации микроорганизмов  на патоке сахарного тростника, содержащей различные сахара, для контроля процесса брожения важно определение суммарного содержания усваиваемых Сахаров  в среде. Так, при высокой концентрации сахара наблюдается подавление катаболизма, что приводит к подавлению роста клеток. Восстановленные сахара и сахарозу в культуральных средах можно определять феррицианидным методом. Этот метод, однако, не вполне надежен, поскольку неусваиваемые сахара могут мешать определению.

Усвоение органических соединений микроорганизмами можно оценивать  по дыхательной активности последних, которую в свою очередь можно  непосредственно измерить при помощи кислородного электрода.

Для непрерывного определения общего содержания усваиваемых Сахаров (глюкозы, фруктозы и сахарозы) в бродильной среде сконструирован микробный  сенсор, состоящий из иммобилизованных живых клеток. Общее содержание усваиваемых  Сахаров оценивали по потреблению  кислорода иммобилизованными микроорганизмами. Добавление аликвотной части глюкозы  приводило к увеличению поглощения кислорода в растворе. В результате электродный ток постепенно понижался, пока не достигал некоторого стационарного  значения. Время отклика сенсора  составляло 10 мин при измерении  стационарного тока и 1 мин в импульсном режиме. Существует линейная зависимость  между уменьшением тока и концентрацией  глюкозы (до 1 мМ), фруктозы (до 1 мМ) и сахарозы (до 0,8 мМ) соответственно. Чувствительность микробного сенсора к этим сахарам оценивается соотношением 1,00: 0,80: 0,92. При использовании растворов, содержащих 0,8 мМ глюкозы, относительное стандартное отклонение для величины уменьшения тока составляло 2%. Общее содержание усваиваемых Сахаров рассчитывали, суммируя значения аналитических сигналов для откликов на глюкозу, фруктозу и сахарозу, при этом разность истинных и расчетных концентраций не превышала 8%. Микробный сенсор помещали в бродильную среду для получения глутаминовой кислоты, где он надежно работал более 10 дней и выдержал 960 измерений.

 Глюкозный сенсор

 

Для определения глюкозы предложен  микробный сенсор, состоящий из иммобилизованных целых клеток Pseudomonas fluorescens и кислородного электрода. Сенсор помещали в исследуемый раствор, который во время измерений насыщали кислородом и перемешивали магнитной мешалкой.

 

 

На рис.2.4 показана типичная зависимость  сигнала сенсора от времени. При 30"С стационарный ток устанавливался в пределах 10 мин. Точное время отклика зависело от концентрации добавленной глюкозы. При удалении микробного сенсора из раствора и помещении в среду, не содержащую глюкозы, ток постепенно возрастал и возвращался к начальному уровню примерно за 15 мин при 30°С.

Сенсор проявляет слабую чувствительность к фруктозе, галактозе, манозе, сахарозе и не чувствителен к аминокислотам. Поэтому избирательность определения глюкозы при помощи этого микробного сенсора можно считать вполне удовлетворительной. При измерениях стационарного тока зависимость между током и концентрацией глюкозы линейна до концентрации 20 мг/л, причем нижняя граница определяемых концентраций глюкозы составляла 2 мг/л. При содержании глюкозы 10 мг/л значение тока воспроизводилось с точностью +6%. Стандартное отклонение составило 6,5 мг/л при числе опытов более 20.

Микробный глюкозный сенсор позволяет  определять концентрацию глюкозы в  патоке со средней относительной  погрешностью ±10%. Для сравнения  глюкозу определяли также ферментным методом; результаты коррелируют с полученными электрохимическим методом.

 Сенсор уксусной кислоты

 

При выращивании микроорганизмов  на уксусной кислоте как источнике  углерода избыток кислоты подавляет  их рост и, следовательно, ее оптимальную  концентрацию следует поддерживать с помощью непрерывного контроля в режиме "на линии".

Пористую мембрану с иммобилизованными  дрожжами закрепляли на поверхности  тефлоновой мембраны кислородного электрода и покрывали другой газопроницаемой тефлоновой мембраной. Таким образом, микроорганизмы помещались между двумя пористыми мембранами. Микробная сенсорная система состояла из проточной ячейки с водяной рубашкой, магнитной мешалки, перистальтического насоса, автоматического дозатора и самописца, регистрирующего ток.

Принцип работы этого сенсора аналогичен описанному выше. Поскольку ацетат-ионы не могут проходить через мембрану, рН пробы поддерживали существенно ниже рК уксусной кислоты (4,75 при 30°С). Что касается избирательности микробного сенсора по отношению к уксусной кислоте, то следует отметить, что он не чувствителен к таким летучим соединениям, как муравьиная кислота и метанол, или нелетучим компонентам питательной среды, таким, как глюкоза или фосфат-ионы. Tiichosporon brassicae могут потреблять пропионовую, н-бутановую кислоты и этанол, однако при ферментации эти вещества обычно отсутствуют либо их концентрация слишком мала, чтобы мешать определению уксусной кислоты.

Для сравнения концентрацию уксусной кислоты в бродильной среде для  производства глутаминовой кислоты определяли описанным микробным сенсором и методом газовой хроматографии. Наблюдается хорошее согласие результатов, полученных двумя методами: коэффициент корреляции равен 1,04 для 26 опытов. Выходной сигнал сенсора (0,29-0,25 мкА) был постоянен (с точностью до +10% от исходного значения) более трех недель, при этом было выполнено 1500 измерений. Теперь этот микробный сенсор выпускается в Японии серийно.

 Сенсор спиртов

 

В бродильных производствах необходимо непрерывно определять концентрации метанола и этанола в культуральных средах. При использовании спиртов в качестве источника углерода для культивируемых микроорганизмов концентрация спиртов должна поддерживаться на оптимальном уровне, чтобы избежать ингибирования субстратом. Как известно, спирты утилизируются многими микроорганизмами, следовательно, такие микроорганизмы можно использовать для конструирования спиртового сенсора [5].