Світлана  Серга

Київський національний університет ім. Т. Г. Шевченка

(науковий  напрям: Біологія та біотехнології) 

  БАКТЕРИИ-ЭНДОСИМБИОНТЫ, МОДИФИЦИРУЮЩИЕ ПОЛОВОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ 

Ключевые  слова: Wolbachia, Cardinium, Spiroplasma, половое размножение

Вступление

     Исследование  взаимодействия эндосимбионтов и их хозяев - актуальная проблема современной биологической науки, важная для формирования правильных представлений о путях и основных направлениях развития органического мира. Среди множества бактерий-эндосимбионтов огромный интерес представляют так называемые репродуктивные паразиты, которые вызывают различные отклонения от нормального полового размножения. Такие бактерии были открыты сравнительно недавно, и вопрос о механизмах взаимодействия с хозяином остается открытым.

     Наиболее  известным среди репродуктивных паразитов (симбионтов) является Wolbachia, которая впервые была описана в 1924 году Хертигом и Вольбахом у комаров Culex pipiens. В 1971 году Йенсен и Барр обнаружили, что Wolbachia вызывает несовместимость в скрещиваниях между инфицированными самцами и неинфицированными самками Culex pipiens. Эти же авторы предложили современное видовое название микроорганизма - Wolbachia pipientis [3]. Интерес к бактерии необычайно возрос, когда стало понятно, что ее эффекты не ограничены несовместимостью, как единственной модификацией репродукции, и комарами, как единственными хозяевами. Сегодня известно, что Wolbachia может вызывать следующие эффекты: цитоплазматическая несовместимость [5,6], феминизация, партеногенез [3] и андроцид [2]. Она была найдена у паразитических нематод, у многих видов членистоногих, в том числе насекомых [4].

     В последние годы было продемонстрировано, что не только Wolbachia может вызывает подобные эффекты, но и бактерии родов Cardinium, Spiroplasma [ 8, 9, 10], которые также являются широко распространёнными в природных популяциях. Причины такого широкого распространения и особенности влияния данных бактерий на жизнеспособность популяций не выяснены.

     Хотелось  бы отметить, что репродуктивные паразиты (симбионты), влияя на половое размножение насекомых, могут стать экологически чистым и безвредным способом борьбы с насекомыми-вредителями сельского хозяйства, а также опасными кровососущими насекомыми. Они могут стать эффективным методом уничтожения малярийного комара, промежуточного хозяина малярийного плазмодия.

     Также разрабатываются методы лечения  заболеваний, вызванных паразитическими  нематодами, у которых найдена  Wolbachia, посредством влияния именно на бактерию. Дело в том, что паразитические нематоды способны выжить только при наличии в них бактерии-эндосимбионта. Убивая бактерию, мы убиваем нематоду, а это можно сделать антибиотиками, например, тетрациклином.

     Но  для понимания биологии данных видов и для использования их в хозяйственных и медицинских целях прежде всего необходимо изучить механизмы их взаимодействия с хозяевами, а также процессы, связанные с жизнедеятельностью этих бактерии в природных популяциях. Для поставленных целей наиболее подходящим модельным объектом является Drosophila melanogaster, которая широко распространена в природе и легко культивируема в лаборатории. Она характеризуется быстрой сменой поколений и значительным числом потомков, что имеет большое значение при изучении полового размножения.

    Исследовались природные популяции Drosophila melanogaster Украины на наличие в них Wolbachia, Cardinium, Spiroplasma, а также соотношение полов в данных популяциях, как способ выявления модификаций полового размножения. Выборки из природных популяции Drosophila melanogaster собраны на территории Украины в восьми различных локалитетах, в летний сезон (август-сентябрь) 2005, 2006 и 2007 годов, а именно: в Киеве, Одессе, Лубнах, Пирятине, Умани, Чернобыле (в трёх местах). Диагностика бактерий-эндосимбионтов проводилась методом ПЦР на наличие 16s рДНК Wolbachia, Cardinium, Spiroplasma.

    Следует отметить, что подобная работа на Украине ранее не проводилась, за исключением случая тестирования популяции из Умани на наличие Wolbachia без описания эффектов.

Результаты  и их обсуждение

    В летний сезон 2005, 2006 и 2007 годов был проведен сбор выборок из природных популяций Drosophila melanogaster Украины. В Лубнах, Умани и Пирятине материал собирали на территории заводов по переработке фруктов, в Киеве и Одессе во фруктовых садах. В исследования были привлечены три группы особей, собранные в прилегающих к Чернобыльской атомной станции районах: Полесском с уровнем радиоактивного фона 50 мкР/час, вблизи водоема охладителя Чернобыльской АЭС (2100 мкР/час),  и непосредственно в городе Чернобыле в яблочном саду (60 мкР/час),

    Все 8 выборок из природных популяций  по соотношению самцов и самок  можно разделить на 3 группы. В  Пирятине и Лубнах количество самцов статистически достоверно превышало  количество самок как в сборе 2005, так и сборе 2006 года. На полученном результате могли сказаться особенности мест сбора материала: основная масса самок, возможно, находилась на субстрате и вследствие этого была недоступна для сбора. Это подтверждают данные анализа выборки популяции из Умани, где в 2006 году мухи собирались непосредственно на субстрате (в отличие от сезона 2005 года), и соотношение полов в выборке составило 1:1, тогда как в 2005 году количество самцов достоверно превышало количество самок [2]. В Киеве и Одессе самки количественно преобладали над самцами в сборах 2005 году, тогда как в 2006 году количество самцов достоверно превышает количество самок. Все три чернобыльские группы особей были крайне малочисленны, что очевидно связано с плотностью природных популяций. Они характеризовались соотношением самцов и самок 1:1 в 2005 году [2], но в сборах 2006 года это соотношение отклоняется в сторону увеличения количества самок в популяциях Полесского и близ водоёма охладителя ЧАЭС. В популяции  города Чернобыль наблюдается соотношение полов 1:1, как и в  сборах 2005 года.                                                                                                                                        

     Дальнейший  анализ соотношения полов при  переходе к лабораторному разведению был проведен для каждой из трех групп популяций отдельно. В выборках из всех природных популяций сбора 2005 года на протяжении пяти поколений лабораторного разведения наблюдалось нерегулярное чередование поколений, в которых соотношение полов либо составляло 1:1, либо количество самок достоверно превышало количество самцов (рис. 1).

    В выборках из популяций сбора 2006 года наблюдается несколько иная картина. На протяжении пяти поколений лабораторного  разведения в выборках из популяций  Лубнов, Полесского и Чернобыля соотношение полов составляет 1:1, тогда как в выборках из популяций Одессы, Пирятина и близ водоёма-охладителя ЧАЭС наблюдается нерегулярное чередование поколений, в которых соотношение полов либо составляет 1:1, либо количество самок достоверно превышает количество самцов, как и в сборах 2005. В то же время в выборках из популяций Умани и Киева в первом поколении лабораторного разведения количество самок достоверно превышает количество самцов, в последующих же четырех поколениях соотношение полов составляет 1:1 (рис. 2).

    Далее все исследуемые популяции сборов 2006 года как и 2005 были перенесены на среду с добавлением тетрациклина. В этих популяциях в течение двух поколений наблюдали четкое соотношение  полов 1:1. На основе этого факта мы предполагаем, что отклонения в соотношении полов вызываются бактериальными эндосимбионтами.

    С помощью ПЦР было установлено  наличие 16s рДНК Wolbachia в препаратах ДНК самок всех популяций сбора 2005 года, а также большинства популяций сбора 2006 года. 16s рДНК Wolbachia не была обнаружена в популяциях Пирятина и близ водоема охладителя Чернобыльской АЭС в 2006 году, что может быть связано с низким уровнем инфицированности мух данных популяций, так как в сборе 2005 года Wolbachia присутствовала [2]. В препаратах ДНК мух, развившихся на среде с добавлением тетрациклина, Wolbachia не была обнаружена.  

     Рис. 1. Соотношение самок/самцов в пяти поколениях лабораторного разведения выборок из природных популяций сбора 2005  
 

    Рис.2. Соотношение самок/самцов в пяти поколениях лабораторного разведения выборок из природных популяций сбора 2006 года.

    Так как для Drosophila melanogaster до сих пор не показано влияние Wolbachia на соотношение полов в популяциях, которое мы наблюдаем, и в то же время подобные эффекты были описаны для бактерий рода Spiroplasma [19,20], выборки из исследуемых популяций сбора 2006 года были протестированы на наличие 16s рДНК данной бактерии, а также на наличие 16s рДНК бактерий рода Cardinium. Результаты тестирования мух из разных популяций приведены в таблице 1.

    Согласно  таблице, Spiroplasma не обнаружена не в одной из исследуемых популяций, в то время как 16s рДНК Cardinium обнаружена в выборках из популяций Киева и города Чернобыля.

    Таблица 1. Результаты тестирования выборок из природных популяций на наличие эндосимбионтов

    По  предварительным данным тестирования мух сбора 2007 года Wolbachia обнаружена в популяциях из Киева, Одессы, Усани, Лубнов. В выборке из популяции Пирятина бактерия не обнаружена. Данные выборки из популяций на наличие других эндосимбионтов протестированы еще не были. Работа по их тестированию ведется в данный момент.

    Выводы

    Показано  наличие бактерий-эндосимбионтов в  природных популяциях Украины, а  также отклонение от теоретически ожидаемого соотношения полов 1:1 в выборках из исследуемых популяций. Причина подобных отклонений в соотношении полов имеет бактериальную природу. В двух популяциях сбора 2006 года  Wolbachia не найдена, что может свидетельствовать о низком уровне инфицированности мух в данных популяциях. При лабораторном разведении часть популяций все время поддерживает соотношение полов 1:1, часть характеризуется постоянным преобладанием количества самок, а часть демонстрирует нерегулярное чередование поколений, где соотношение полов составляет 1:1, либо количество самок достоверно превышает количество самцов, в отличие от сборов 2005 года, когда все популяции характеризовались нерегулярным чередованием поколений.

    Полученный  результат открывает новые вопросы, на которые ещё предстоит дать ответы. А именно необходимо выявить какой именно симбионт вызывает описанные эффекты в природных популяциях, а также характер взаимодействия различных видов эндосимбионтов. Разрешению данных вопросов и будет посвящена моя дальнейшая работа.

Список  литературы

1. Гершензон С.М. Аналитический обзор исследований по популяционной генетике, проведенных в Национальной академии наук Украины.- Киев. – 1996.- 72 с.
2. Проценко А.В., Жук О.В., Козерецкая И. А. Соотношения полов в природных популяциях  Drosophila melanogaster Украины// Вісник – 2006. – т.4 - №2. – С.193-199.
3. И.А.Захаров. Бактерии управляют половым размножением насекомых // Природа. – 1999. - №5. – C. 48-57
4. Горячева И.И. Бактерии рода Wolbachia - репродуктивные паразиты членистоногих // Успех. совр. биол. – 2004. – Т. 124. – № 3. – С. 246-259.
5. Charlat S., Le Chat L., Mercot H. Characterization of non-cytoplasmic incompatibility inducing Wolbachia in two continental African populations of Drosophila simulans // Heredity. - 2003. – Vol.90, N.1. – P.49-58.
6. Charlat S., Bonnavion P., Mercot H. Wolbachia segregation dynamics and levels of cytoplasmic incompatibility in Drosophila sechellia // Heredity. – 2003. – Vol.90, N.2. – P.157-203.
7. Vavre F., Fleury F., Varaldi J., Fouillet P. Evidence for female mortality in Wolbachia-mediated cytoplasmic incompatibility in haplodiploid insects: epidemiologic and evolutionary consequences // Evol. Int J Org Evol.- 2000.- Vol.54.- №1.- P.191-200.
8. Hurst GDD, Walker LE, Majerus MEN. Bacterial Infections of Hemocytes Associated with the Maternally Inherited Male-Killing Trait in British Populations of the Two Spot Ladybird, Adalia bipunctata // J Invertebr Pathol.- 1996.- V.68.- №3.- P. 286-292.
9. Montenegro H, Solferini VN, Klaczko LB, Hurst GD. Male-killing Spiroplasma naturally infecting Drosophila melanogaster. // Insect Mol Biol.- 2005.- Vol.14.- № 3.- P.281-287.
10. Montenegro H, Petherwick AS, Hurst GD, Klaczko LB. Fitness effects of Wolbachia and Spiroplasma in Drosophila melanogaster. // Genetica.- 2006.- Vol.127.- № 1-3.- P.207-215.
11. Anbutsu H, Fukatsu T. Population dynamics of male-killing and non-male-killing spiroplasmas in Drosophila melanogaster. // Appl Environ Microbiol.- 2003.- Vol.69.- № 3.- P.1428-1434.
12. Gotoh T, Noda H, Ito S. Cardinium symbionts cause cytoplasmic incompatibility in spider mites. // Heredity.- 2006.- Vol.11.- P 238-245.
13. Roberts D.B. Drosophila a practical approuch. – Oxford. – 1986.-295 р.
14. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. - М.: Медицина, 1975. - 296 с.
15. Chigira A, Miura K.Detection of 'candidatus Cardinium' bacteria from the haploid host Brevipalpus californicus (Acari: Tenuipalpidae) and effect on the host. // Exp Appl Acarol.-2005.-Vol.37.-P.107- 16.