Флуориметрия

     Интенсивность флуоресценции (испускаемой во всех направлениях) зависит от количества поглощаемого флуоресцирующим объектом света и квантового выхода флуоресценции :

       F = I₀ (1 – 10^-D) (2),

     где: F - общая интенсивность флуоресценции;

     D - оптическая плотность раствора.

     При малых величинах D« 0,1 формула (2) имеет следующий вид:

     F = 1₀ ф(1 - (1 - D + D²/2' - D³/3' In), (3) или F = I₀ D (4). Таким образом, зависимость F от D (с учетом значения квантового выхода и интенсивности возбуждающего света) является линейной, что более удобно для экспериментальных исследований. Переход к линейной зависимости позволяет рассчитывать концентрацию флуорофоров по законам светопоглощения.

     Однако  необходимо вычислить минимальное  значения оптической плотности раствора D₀, при которых ошибка измерения интенсивности флуоресценции не превышает некоторой заданной величины.

     Как правило, линейная зависимость флуоресценции  от концентрации раствора наблюдается  до тех пор, пока количество флуоресцирующего вещества не становится настолько большим, что раствор начинает поглощать  значительное количество возбуждающего  света. Боуен и Уокс показали, что  для получения линейной зависимости  раствор должен поглощать менее 5% возбуждающего света. Поэтому D_n = 2,0x0,05 = 0,1, то есть предел линейной зависимости флуоресценции от концентрации определяется достижением оптической плотности D = 0,1.

     Поскольку D = KCL, то одной и той же оптической плотности могут соответствовать различные концентрации в зависимости от толщины поглощающего слоя. Следовательно, использование кювет с различной толщиной рабочего слоя позволяет применять флуориметрию для измерения высоких концентраций без предварительного разбавления проб. При практическом использовании этого приема выявлена закономерность, связывающая изменения толщины рабочего слоя кюветы и предела обнаружения методики: при уменьшении рабочего слоя в 2 раза верхний пределе линейности калибровочного графика увеличивается в среднем в 1,4 раза.

     Измерения отношения интенсивности флуоресценции  вещества к интенсивности облучающего  пробу светового потока (F/I₀) позволяет определять величину, подобную оптической плотности в спектрофотометрии. Эта величина зависит только от концентрации исследуемых веществ при использовании стандартных кювет, что позволяет стандартизовать измерения флуоресценции и избавится от необходимости использования стандартных растворов

     Характер  и интенсивность флуоресценции  вещества зависят не только от его  структуры, но и от растворителя.

     Те  вещества, которые в твердом состоянии  флуоресцируют фиолетовым светом, в  растворе должны быть лишены флуоресценции  в видимой части спектра. В  большинстве случаев спектр флуоресценции  вещества при его растворении  немного смещается в сторону  более коротких длин волн. Однако смена  растворителя также вызывает неоднозначные  изменения флуоресцентных свойств  растворов.

     Зависимость флуоресценции от природы растворителя в одних случаях выражается в  незначительном смещении полосы или  ее максимума. В других - к исчезновению, или проявлению флуоресцентных свойств. Так производные антрацена в  н-гексане имеют характерный спектр флуоресценции и не флуоресцируют  в воде и спиртах.

     Наиболее  сильно проявляется зависимость  флуоресценции от рН растворителя, особенно, если вещество обладает выраженными  кислотными или основными свойствами. Области флуоресценции нейтральной  молекулы и ионизированной молекулы значительно различаются.

     Взаимодействия  между молекулами растворенного  вещества и растворителя обычно разделяют  на следующие типы: 1) между диполями, 2) между электронными системами, 3) химические взаимодействия. При каждом из трех типов взаимодействия могут усиливаться  флуоресцентные свойства растворов, если взаимодействие приводит к стабилизации структуры растворенного вещества.[8]

 

      1.1 Подбор оптимальных условий флуориметрирования

     Одна  из главных проблем связана с  растворителем пробы. Нередко случается, что некоторая методика вполне пригодна для определения данного соединения, однако проба оказывается нерастворимой  в рекомендуемом растворителе. В  настоящее время известно, что  титрование можно проводить во многих органических растворителях. Если рекомендуемый  в методе растворитель не растворяет пробу, то всегда удается подобрать  другой растворитель, в котором можно  провести титрование. При выборе растворителя следует учитывать реакционную  способность проб. Например, ангидриды  кислот или хлорангидриды реагируют  со многими растворителями, однако, можно подобрать растворители, которые  с ними не реагируют и в которых  можно провести титрование. К таким  растворителям относятся диметилформамид, ацетон и хлорбензол. Кроме того, некоторые растворители могут оказывать  влияние на аналитическую реакцию. Поэтому необходимо подобрать такие  растворители, в которых растворяются и проба, и реактив и возможно протекание химического процесса.

     Применение  неводных высококипящих растворителей  позволяет ускорять особенно медленные  аналитические реакции.

     Образование флуоресцирующих комплексных соединений

 

     1.2 Разработка флуоресцентных методик

     Флуоресценция органических веществ связана с  электронным строением молекул  и поэтому любые изменения  структуры приведут к возникновению  и изменению интенсивности и  цвета флуоресценции и ее исчезновению. Поэтому при решении задач, связанных  со специфическим обнаружением вещества в сложной смеси, наиболее полно  реализуются все достоинства  флуоресцентного анализа - его чувствительность, специфичность к структуре и  простота используемого оборудования.

     При определении примеси можно использовать все приемы создания флуоресцентных реакций, которые помогут отличить их от основного вещества. Наиболее перспективными считаются флуоресцентные реакции с использованием комплексообразования.

     Ряд соединений (4-окси-6-птеридинкарбоновая, салициловая и антраниловая кислоты, кверцетин, 8-оксихинолин, фенилсалицилат) являются источниками примеси в  ряде фармацевтических препаратов, так  как используются для синтеза  ряда лекарственных средств, либо возникающие  при хранении. Используя различия (растворимость, флуоресцентные свойства, реакционная способность) этих соединений от основных веществ, нами разработаны  методики определения салициловой  кислоты в ацетилсалициловой  кислоте, кверцетина в рутине и 4-окси-6- птеридинкарбоновой кислоты в фолиевой кислоте.

     1.3 Поиск флуоресцентных реакций на салициловуюкислоту

     Фенолы, содержащие в орто-иоложении карбонил и карбоксил, образуют флуоресцирующие  продукты с рядом катионов s-, р-, d-элементов.

     Сине-голубую  флуоресценцию с катионами A1^J+, Mg²⁺, Sc^J в среде этилового спирта дают: салициловая кислота, салициловый альдегид, 2,3- диоксибензойная кислота, сульфосалициловая кислота, салицилат Na, салицилат Са, ПАС Na, Бепаск, фенилсалицилат, салициламид, оксафенамид, дихлорсалициламид оксибензола и оксинафталина. Области возбуждения флуоресценции лежат в пределах 330-370 нм, а излучения флуоресценции - 400 - 430 нм. В отличие от оксибензольных производных, оксинафтойные соединения в диметилформамиде с солями скандия образуют голубую флуоресценцию. Это позволяет различать производные бензола и нафталина.

     Образование флуоресцирующих комплексных соединений

 

     В среде диметилформамида бенз-, нафт- и пиридин-оксиальдегиды образуют флуоресцирующие комплексы с  солями магния и алюминия, а соединения с кетогруппой (2-оксибензофенон, 2-окси-З-ацетибензол  и т.д.) взаимодействуют с солями цинка.

     В рассмотренных соединениях присутствует структура, содержащая ароматический  гидроксил с расположенной в  орто-положении к нему группой  R-C=0, где R может быть представлен группировками -OR, -Н, - CH₂R. -NHR.

     Ортооксибензойная кислота, ее соли и сложные эфиры, где R - Н, NH₄, Na , Са²⁺, Mg²⁺, СН₃-С₂Н5-,СбН₅ - образуют флуоресцирующие комплексы с солями алюминия и скандия окрашенные в фиолетовый или голубой цвет в среде этилового спирта. Салициламид и его N-производные, где R - Н, С₆Н₅, СбН₄С1, C₆H₄NH₂, образуют с солями магния флуоресцирующие комплексы в присутствии спирто-водно-щелочного раствора.

     Соли  цинка в среде диметилформамида образуют флуоресцирующие

     комплексы с соединениями, содержащими кетогруппу, где R¹ - орто-оксибензол, a R" - метил, бензил и т.д.

     Обоснована  гипотеза образования комплексного соединения, в котором катион связан ковалентной связью с кислородом фенольного гидроксила и донорно-акпепторной  связью с кислородом карбонильной или  карбоксильной группы. Формирование дополнительного шестичленного  цикла приводит к увеличению энергии  резонанса и сдвигу в видимую  область.

     Строение  продуктов, получаемых в результате взаимодействия перечисленных групп  соединений с катионами металлов, было изучено методами ИК- и ЯМР-спектроскопии. Результаты исследования подтвердили  образование флуоресцирующих производных  по общей схеме комплексообразования: комплекс образует структура, имеющая  свободный (подвижный) водород фенольного гидроксила, а в орто-положении  к нему радикал с неподеленной электронной парой, способной участвовать  в образовании донорно-акцепторной  связи. Соответствующие схемы представлены ниже: 

 

       

       

       

       

     Образование флуоресцирующего комплекса предполагает наличие устойчивой электронной  группировки между оптическими  электронами органической части  молекулы и полем иона металла. Наиболее эффективны ионы, уровни которых пусты  или полностью заполнены электронами. Это связано с зависимостью возмущения ионного поля от экранирования оптических электронов уровнями самого иона: незаполненные  уровни облегчают рассеивание флуоресценции  и внутреннее гашение за счет электронных  переходов. Так к катионам, которые  обычно образуют флуоресцирующие комплексы, относят Са²⁺, Mg²⁺, Al³⁺, Zn²⁺, Sc^,+ и лантаноиды,реже ионы, типичных переходных металлов.[9]