Возможности установления видовой специфичности биологических объектов при провдении экспертизы вещественных доказательств

    3. Все моющие средства оказывали  неблагоприятное влияние на пятна  крови курицы.

    4. В тех случаях, когда ткань  после застирования недостаточно  прополощена, не исключается появление  неспицифических явлений в реакции кольцепреципитации.

    Л.О. Барсегян и соавт. предложили использовать лазерный индикатор иммунных реакций  – ИРЛ-110. Работа лазера основана на распознавании комплекса антиген-антитело. Кинетический метод основывается на одномоментном введении антигена и антитела, метод сравнения – на трехэтапном введение – вначале антигена, затем антитела, затем комплекс-антиген – антитело. Введению комплекса предшествует 30-минутная экспозиция. Все вводимые ингредиенты следует тщательно очистить от посторонних примесей. Они не должны содержать средне-крупнодисперсных включений. Очищение  достигается центрифугированием либо фильтрованием объектов перед введением их в реакцию.

    Реакция преципитации в твердой  среде. При работе с мутными вытяжками. Когда не центрифугирование, ни фильтрование не позволяет устранить замутнение, целесообразно реакцию преципитации осуществлять в агаре. Впервые реакция была предложена O.Ouchterlony (1949). Принцип ее заключается в следующем. В агаре в две лунки помещается антиген и антитело. Ингредиенты диффундируют друг к другу и в месте контакта образуется полоса преципитации. Преципитация в агаре может быть проведена на предметных стеклах, в чашках Петри, на стеклянных пластинах. Рабочим разведением является 1% раствор агара. Специальным металлическим пробойником в агаре проделываются отверстия. Отверстия могут располагаться различно- их может быть три, пять, шесть. Расстояние между центральным отверстием и отверстиями, расположенными по периферии, составляет 3-5мм.

    Перед проведением реакции проверяют титр и специфичность сывороток.

    Электрофоретические методы определения

    Видовой принадлежности объектов.

    В настоящее время для определения  видовой принадлежности белка крови  и других биологических объектов, помимо классических методов применяется  реакция встречного иммуноэлектрофореза- (электропреципитация).

    Электропреципитация сочетает в себе преимущества реакции  преципитации в геле с чувствительностью, превосходящей реакцию в жидкой среде; метод обеспечивает проведение реакции в более сжатые сроки и используется для установления:

    1.видовой  принадлежности крови на вещественных  доказательствах, включая объекты  малой величины.

    2.видовой  принадлежности мышц:

    3.видовой  принадлежности костей:

    4.при  исследование мутных вытяжек;

    5. при плохой растворимости белков исследуемого объекта;

    6. при неспецифических явлениях  в реакции кольцепреципитации.

    Впервые метод был предложен в 1959 г. A.Bossardom.

    Принцип метода. При электрофорезе в агаре перемещения белков под воздействием электрического поля определяется двумя силами: зарядом белка и величиной элетроосмотического потока жидкости внутри носителя.

    Агаровый  слой представляет собой сеть капилляров (губку), стенки которой при pH7-9 заряжено отрицательно. В жидкости в близи стенок агаровой трубки скапливаются положительно заряженные ионы в следствие чего практически вся жидкость в агаре заряжена положительно по отношению к твердой фазе. При наложении электрического поля положительные ионы передвигаются к катоду, увлекая за собой и жидкую фазу. Возникает электроэндоосмотический поток, т.е. передвижение жидкости в пористой среде под влиянием электрического поля.

    В 1% агаровом геле, приготовленном на барбиталовом буфере с pH 8,6, наступает разделение белков в двух направлениях. Антитела, являясь глобулинами, перемещаются от анода к катоду. Это обусловлено как положительным зарядом антител, так, и явлением электроэндоосмоса. Большинство антигенов заряжены отрицательно, в результате чего движутся к аноду. Явление электроэндоосмоса, имеющего противоположное направление, не отражается на направлении движения антител, хотя несколько замедляет их скорость.

    При одновременном внесении и соответствующем расположении в геле антител и антигенов они движутся на встречу друг другу, а гомологичные, вступают в реакцию между собой, образуют при этом преципитат в виде полос белого цвета.

    Метод встречного электрофореза на ацитат-целлюлозной пленке. Практически только этим методом в силу его высокой чувствительности возможно установить видовую принадлежность мочи, а также вид белка в подвергавшихся тщательному уничтожению следах крови.

    В основе встречного электрофореза на ацетатной пленке лежит образование  специфических не растворимых преципитатов в результате миграции антигенов  на встречу друг другу под воздействием электрического поля.

    Электрофорез на пленках из ацетата целлюлозы имеет ряд преимуществ по сравнению с другими носителями (агаром, полиакрилом и др.). К ним относится следующее:

    -ацетат  – целлюлозная пленка всегда  готова к использованию, отпадает  необходимость в подготовительных  операциях, что значительно сокращает время проведения исследований;

    -пленка  отличается однородностью структуры,  отсутствием абсорбции белка,  стабильностью физико-химических  свойств;

    - для  исследования на ацитат-целелозной  пленке требуется небольшое количество объекта (1-2 мкл);

    -результаты  исследования можно хранить (срок  хранения не ограничен) и использовать  в качестве документального и иллюстративного материала.

    Для проведения этого исследования необходим  аппарат «ЭПАУ-20» , пленки из ацитатцелюлозы, электродный буферный раствор, раствор для окрашивания.

    Ацетатцеллюлозную пленку в течение 2-3 мин. Смачивают  электродным буферным раствором, отжимают между двумя листами фильтровальной бумаги и формируют стартовые  канавки. Пленку закрепляют в рамку, которую помещают в камеру деления  таким образом, чтобы концы ее были погружены в буферный раствор. Электрофорез проводят в течение 20-30 мин. при напряжении 200 В. По окончании электрофореза пленку отмывают изотоническим раствором хлорида натрия в течение 30-40 мин. для удаления свободных белков, затем окрашивают 4-5 мин. и вновь отмывают дистиллированной водой. Положительным результатом считают образование между стартовыми канавками четко различимых преципитатов.

    Большой набор методов  позволяет экспертам  исследовать практически любые следы, содержащие кровь, и в частности, замытые и старые пятна. В то же время нельзя обойти молчанием такую известную истину – высокая чувствительность может отрицательно сказаться на специфичности реакции. Учитывая, что  эксперты чаще всего имеют дело со значительно загрязненными предметами, этот факт необходимо принимать во внимание во избежание получения ложноположительного результата.

    В свете сказанного значительный интерес  представляет т.н. OBTI – тест  (набор для иммунохроматографического одноэтапного определения скрытой крови в кале).

    Набор обти-тест представляет собой продолговатую  пластину с двумя небольшими углублениями округлой и продолговатой форм. Пластинка  содержит нитроцеллюлозную мембрану, на которую нанесены мышиные монокланальные антитела против гемоглобина человека и антигены козы против  Ig G мыши. Внутри упаковки помещена специальная таблетка-осушитель, препятствующая увлажнению мембраны. В набор помимо описанной и герметически упакованной мембраны входит специальный флакончик с трисбуфером и аппликатор для экстрагирования исследуемого материала.

    Набор пригоден в течении длительного  времени, его следует хранить  при температуре +2-30*С, нельзя замораживать, перегревать.

    Ход реакции – изучаемый материал в пробирках заливался двумя каплями прилагаемого к набору экстракта и оставался для экстрагирования на несколько часов. Обе капли вносили в округлое образование на пластинке и в течение 2-3 минут учитывали результаты. Если на мембране появлялась одна четкая полоса, то это свидетельствовало о правильности проведенной реакции и об отсутствии в изучаемом материале крови человека. если на мембране образовывались две параллельные синие полоски, то из этого следовало, что в материале есть кровь человека. Для решения вопроса об отсутствии крови время наблюдения следует продлевать до 10 мин., так как в ряде случаев при значительном разведении крови (1:15000) вторая полоса проявлялась к 10 минутам наблюдения.

    Тест  специфичен и не дает положительной  реакции с кровью различных животных. Высокая чувствительность теста позволяет эффективно исследовать замытые следы крови и следы ее значительной давности.

    Следует иметь в виду возможность получения  отрицательного результата теста при  наличии крови животного особенно, на различных орудиях. В этом случае рекомендуется следы, напоминающие кровяные, дополнительно изучить в других реакциях.

    Обти-тест позволяет установить одномоментно наличие и вид крови человека. Однако, в связи с относительной  дороговизной наборов обти-теста  широкое применение его ограничено. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    ЗАКЛЮЧЕНИЕ 

    В заключение ко всему вышеизложенному, следует отметить, что в арсенале судебных медиков в настоящее  время имеется достаточное количество иммунологических и неиммунологических методов, применение которых в зависимости от вида и характера исследуемых следов, позволяет установить видовую принадлежность биологических объектов в экспертизе вещественных доказательств. 

      
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    СПИСОК  ЛИТЕРАТУРЫ 

    

1. М.А.Броникова, А.С.Гаркави

    “Методика и техника судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств”.

    Москва  – 1963 год, 277стр. 

    

2. В.В.Томилин, Л.О.Барсегянц, А.С.Гладких

 

    “Судебно-медицинское  исследование вещественных доказательств”

    Москва-1989 год, 295стр. 

    

3. А.К.Туманов

    “Судебно-медицинское  исследование вещественных доказательств”

    Москва-1961 год, 295стр. 

    

4. Методические  рекомендации по оформлению исследовательской  части заключения эксперта

    Москва-2003 год, 13стр.