Тканевые биосенсоры

     Время жизни этого биосенсора 18 дней. Диапазон линейности 2*10^-5 - 8*10^-4 М. L. Macholan и В. Chelikova измеряли концентрацию аскорбиновой кислоты, используя срезы ткани кабачка или огурца, прикрепленные к кислородному электроду. Ткани этих овощей богаты ферментом аскорбатоксидазой (АО), которая катализирует следующую реакцию:

     Этот  сенсор не реагировал на другие органические кислоты, фенолы, аминокислоты и глюкозу. Его линейный диапазон 0,02 - 2*10^-3 М, время отклика 70-90 с. Большей чувствительностью к аскорбиновой кислоте обладает биосенсор на основе сока огурца, иммобилизованный в пористой угольной пасте. Диапазон линейности этого сенсора 2,5*10^-4 -1,6*10^-3 М, а время отклика 3-6 мин.

     Срез ткани кабачка, прикрепленный к поверхности амперометрического биосенсора, позволяет определить концентрацию дофамина и норэпинефрина в присутствии аскорбиновой кислоты, мешающее влияние которой в данном случае обусловлено близкими значениями окислительно-восстановительных потенциалов этих веществ. АО кабачка элиминирует аскорбиновую кислоту с поверхности электрода.

     Для измерения концентрации дофамина описан биосенсор, содержащий ткань банана, богатую ПФО. Реакция идет с потреблением кислорода

     Линейный диапазон 1,3*10^-6 - 9*10^-5 М, время отклика 12 с, время жизни 10 дней. Сенсор позволяет проводить 60 анализов в час.

     Описан  биосенсор для определения мочевины, в котором используется мука из бобов канавалии мечевидной. Мука содержит большое количество фермента уреазы, катализирующей следующую реакцию:

     В качестве трансдуктора в данном биосенсоре был использован аммиачный электрод. Этот датчик выделяется среди других большим временем жизни - 94 дня. Повышенный уровень мочевины может быть связан с острой почечной недостаточностью, диабетической комой, желудочно-кишечными кровотечениями, недостаточностью кровообращения. Пониженный уровень наблюдается при циррозах печени, острой желтой атрофии, отравлениях фосфором, мышьяком и другими ядами, поражающими паренхиму печени.

     Биосенсор, содержащий срез сахарной свеклы, прикрепленный  к кислородному электроду, позволяет  измерять тирозин, количественное определение  которого важно при заболеваниях щитовидной железы. Время жизни сенсора 8 дней. Тирозин можно определять и с помощью биосенсора на основе тканей грибов, содержащих тирозиназу или ПФО. Известно несколько гибридных биосенсоров, в которых, кроме ткани, иммобилизован еще и фермент. Так, сенсор на фосфат и флюорит включает срез картофеля, содержащий кислую фосфатазу (КФ) и иммобилизованную глюкозооксидазу (ГО). Реакция имеет две стадии

     В качестве трансдуктора используется кислородный  электрод. Диапазон линейности 2,5*10^-5 —1*10^-4 М. Биосенсор позволяет провести около 300 анализов. Время жизни 28 дней.

     Разработан также гибридный биосенсор на основе ткани картофеля с добавлением глюкуронидазы, позволяющий определить концентрации соответствующих субстратов в макромолекулярном диапазоне. При комнатной температуре время жизни датчика превышало 2 мес. В перспективе такого типа сенсоры могут быть использованы при диагностике мукополисахаридозов. 

     Описан  целый ряд биосенсоров на аминокислоты, содержащих в качестве биокаталитического материала компоненты цветков растений. Так, сенсор, включающий кашицу тычинок хризантемы, используют для измерения концентрации L-аргинина (до 1*10^-3 М), L-орнитина (до 1*10^-2 М), мочевины (2*10^-3 — 3*10^-4 М). Использование срезов пестика позволяет измерять, кроме этих веществ, еще и L-цитруллин и L-пролин. Очевидно, тычинки и пестик содержат ферменты, катализирующие соответствующие реакции (аргиназу, аргининсукцинатсинтетазу, аргининсукциназу)

     Кроме того на основе ткани цветков магнолии разработан биосент; сор на L-глутанин и L-аспарагин.

     Описан  биосенсор на основе ткани огурца на аминокислоту цисте-ин. Реакция идет с выделением NH3. Время жизни сенсора 28 дней.

     В университете г. Канагава (Япония) разработан биосенсор для определения концентрации аминокислот на основе ткани семян сельдерея или петрушки. Муку семян наносили на поверхность аммоний-селективного электрода и покрывали сверху целлофаном. Таким биосенсором можно было определить концентрацию 20 аминокислот в диапазоне от 2 до 250 мг/л. Недостатком биосенсора является низкая селективность, обусловленная тем, что семена содержат несколько ферментов, разлагающих аминокислоты. Поэтому если в растворе содержится несколько аминокислот, то возможно определение лишь их суммарной концентрации.

     Аминокислоты  имеют важное диагностическое значение при многих заболеваниях. Изменение их концентрации, в частности, может свидетельствовать об изменении содержания общего аминного азота в сыворотке и моче, что служит одним из показателей превалирования катаболических или анаболических процессов в организме, сопровождающих ряд патологических процессов. Количество аминокислот в крови увеличивается при заболеваниях печени (при тяжелых заболеваниях печени повышается содержание в крови цистеина, метионина, ти розина, глутаминовой кислоты), что связано с пониженным синтезом мочевины при экссдативном диатезе, спазмофилии, фенилкетонурии, различных инфекционных заболеваниях, опухолях, тяжелых оперативных вмешательствах и т. д. При пониженной выделительной способности почек содержание аминокислот в крови увеличивается совместно с остальными фракциями остаточного азота. Гипераминоацидурия встречается при заболеваниях паренхимы печени, что связано с нарушением в этом органе процессов дезаминирования и переаминирования, а также в связи с усиленным распадом клеток, при тяжелых инфекционных заболеваниях, злокачественных новообразованиях, тяжелых травмах, миопатии, коматозных состояниях, гипертиреозе и других патологических состояниях. При врожденном заболевании гиперпролинемии, возникающем вследствие недостатка фермента пролиноксидазы, наблюдается повышенная концентрация пролина. Увеличенное количество в моче цитруллина имеет место при цитруллинемии (врожденном нарушении цикла образования мочевины, обусловленное недостатком фермента агиниинсущинатсинтетазы.

     В пируватном сенсоре тонкий срез кукурузного зерна фиксировали на поверхности датчика к диоксиду углевода. Содержащаяся в зерне пируватдекарбоксилаза (ПДК) катализировала следующую реакцию:

     Диагностическое значение определения концентрации пирувата связано с тем, что наиболее резкое повышении его концентрации в крови отмечается при мышечной работе и недостаточностью витамина В₁ при паренхиматозных заболеваниях печени, сахарном диабете, сердечной декомпенсации, токсикозах и некоторых других заболеваниях. В спинномозговой жидкости концентрация пирувата значительно повышается после травмы черепа, при воспалительных процессах (менингите, абсцессе мозга).

     Создано и описано несколько биосенсоров  на основе животных тканей. Так в глутаминовом электроде и сенсоре на глюкозамин-6- фосфат используется тонкой срез (около 0,05 мм) свиной почки, а в электроде, чувствительном к 5-аденозитмонофосфату, - слой мышечной ткани кролика, срез печени кролика, входящий в состав биосенсора на гуанин содержит ферменты превращения гуанина в ксантин с выделением аммиака. Время отклика 2-3 мин, диапазон линейности 1,12*10^-5 -1,0* 10^-4 М. Биосенсор на гуанин разработан также на мозге крысы. Линейный участок рабочей характеристики этого биосенсора от 0,02 до 0,63 мМ, время жизни 28 суток. Индикаторным электродом во всех этих биосенсорах служит аммиачный газочувствительный электрод. В биосенсоре, чувствительном к аденозину, применяют смесь клеток, выделенных из внешней слизистой оболочки тонкой кишки мыши. Время жизни описанных сенсоров 21-30 дней.

     Некоторые ткани животных обладают высокой активностью фермента моноаминоксидазы (МАО). В биосенсоре на основе печени крысы для определения субстратов МАО катехоламинов и индоламинов срезы толщиной 25 - 200 мкм, изготовленные на криомикротоме, помещаются на нейлоновую сетку. В процессе измерения они инкубируются вместе с образцом 20 мин. Затем пробы инжектируются в прочную термостатируемую ячейку с аммоний-селективным электродом для oпpeделения концентрации образовавшегося аммония:

     Диапазон  измерения концентрации аммония 1-10 мМ. Сенсор жет быть использован в 20 измерениях в течение 20 - 25 дней.

     Чешуя определенных видов рыб (например, Labrus assifagus) coдержит специальные клетки (хроматофоры) с гранулами пигментов, которые могут быть расположены дисперсно или создавать агломераты в клетках. Степень агрегации определяется норадреналином, выделяемым симпатическим нервом, заканчивающимся в коже рыбы. Изолированная чешуя сохраняет большую чувствительность к норадреналину и другим катехоламинам в течение нескольких недель. На этой основе созданбиосенсор для определения концентрации катехоламинов в плазме крови человека. Диагностика катехоламинов представляет собой интерес, так как они обладают широким диапазоном биологических свойств, позволяющих им активизировать процессы высвобождения энергии (стимуляция гликогенолиза, липолиза, окислительных процессов), возбуждать активность нервной системы, усиливать и учащать сокращения сердца, повышать периферическое сопротивление ряда сосудистых областей и т. д. Клиническое значение определение дофамина имеет при диагностике опухолей симпатических нервных образований и хромаффинной ткани, диабета, поражений почек, цирроза печени, гепатита, гиперкортицизма и других заболеваний. Повышение уровня катехоламинов в крови наблюдается при феохроматомах, сердечной недостаточности, острой пневмонии и бронхиальной астме и других патологических состояниях.

     S. Hoath и соавт. рассматривают возможность использования эпидермиса млекопитающих для создания сенсоров на определенные биогенные соединения.

     S. Updike и I. Treichel разработали биосенсор на антидиуретический гормон. На стеклянный натрий-селективный электрод натягивается мочевой пузырь жабы. В присутствии гормона в исследуемом растворе через стенки пузыря происходит перенос ионов натрия. Отклик натриевого электрода прямо пропорционален концентрации гормона. Определение антидиуретического гормона имеет диагностическое значение при заболеваниях, связанных с нарушениями водного обмена, в частности при несахарном диабете. При недостаточной его выработке происходит избыточная потеря жидкости организмом.

     Основные  исследования в области биосенсоров  имеют целью создание коммерческих образцов, которые характеризовались бы длительным временем жизни и стабильностью своих основных характеристик. Однако если говорить об использовании тканевых биосенсоров в научных исследованиях, то необходимо отметить, что существует большое число направлений в области электрофизиологии, фармакологии, нейробиологии, где используются биологические тес-системы, некоторые из которых можно рассматривать как тканевые биосенсоры или их предшественники. Так, например, еще вначале 30-х годов W. Feldberg использовал в качестве теста на ацетилходин спинную мышцу венгерской пиявки Hirudo officinalis. Было показано, что ацетилхолин является практически единственным веществом, обнаруживаемым в крови, которое вызывает сокращение этой мышцы.

     В 50-х годах был разработан препарат для исследования вкусовых рецепторов мясной мухи. На вкусовые волоски, расположенные на хоботке мухи, надевалась стеклянная трубка, которая служила и для подведения тестируемых веществ к рецепторам, и одновременно являлась отводящим электродом. На основании анализа импульсной активности рецепторных клеток было установлено, что существует два типа рецепторов: одни высокоспецифичны для Сахаров, а другие, менее специфичные, реагируют на соли и целый ряд веществ, не представляющих для мухи пищевой ценности. Время отклика такой системы на химический стимул составляло несколько миллисекунд.

     Не  так давно появились разработки нового типа биосенсора на основе хеморецепторных структур, находящихся в антеннулах крабов ("рецептрод").  Выделенные усики помещали в термостатированную проточную камеру таким образом, что хемочувствительный кончик антенул находился в протоке, а нейроны и отходящие от них аксомы были в отдельном отсеке, заполненном искусственной морской водой. Импульсную активность нервных клеток регистрировали с помощью внеклеточного стеклянного микроэлектрода. Анализируемый раствор вводили в проток, и если в пробе содержались вещества, обладающие срод-, ством к рецепторам, то по изменению импульсной активности нейронов ; можно было определить концентрацию тестируемого вещества. С помощью "рецептрода", полученного из усиков голубого краба, удалось,; определить концентрации всех 20 аминокислот. Для глутамана предел обнаружения был равен 10" М.

     При исследовании биосенсора на основе интактных  хеморецепторов из усиков гавайских крабов было найдено, что время отклика сенсора на триметиламин-К-оксид (маркера возможной пищи крабов) состав ляет миллисекунды, а диапазон измеряемых концентраций - от 10 до 10" М. На основе хеморецепторных структур речного рака разработаны также биосенсоры для детектирования пирозинамида, 3-ацетилпиридина и определения концентраций ряда местных анестетиков.

     Достоинствами такого типа сенсоров является короткое время отклика (миллисекунды), высокая специфичность и чувствительность, широкий динамический диапазон, а основным недостатком - небольшое время жизни - 8-24 ч. Однако разработчики этих биосенсоров полагают, что время жизни таких систем может быть увеличено до 100 - 250 дней.

ПРОБЛЕМЫ  И ПЕРСПЕКТИВЫ  РАЗВИТИЯ.

Концепция распознавания определяемого вещества с помощью иммобилизованного  биоматериала оказалась плодотворной. В итоге исследователи приобрели новое средство, позволяющее быстро получить достоверную информацию о состоянии окружающей среды и здоровья человека. Некоторые биосенсоры уже получают распространение для индивидуального использования в домашних аптечках (чаще всего для определения сахара в крови). Интерес к биосенсорам непрерывно растет. В 1996 году состоялись четыре крупные международные конференции по биосенсорам.

Если иметь  в виду все разнообразие ферментов, присутствующих и действующих в  живом организме и являющихся потенциальными биологическими преобразователями, то следует отметить, что существующее сегодня число конструкций биосенсоров может быть увеличено в десятки и даже сотни раз. Биосенсоры получают распространение в биотехнологии. Хотя здесь и встречаются трудности, связанные с невысокой термической устойчивостью предложенных устройств, приводящей к дезактивации биослоя, есть основания полагать, что данный недостаток будет в скором времени преодолен. Так, полагают, что для увеличения срока службы биосенсоров в обозначенных выше условиях можно использовать ферменты, выделенные из термофильных бактерий и одноклеточных водорослей - микроорганизмов, устойчивых к действию высоких температур. Определенные трудности представляют собой также проблемы градуировки биосенсоров и надежности их показаний. Для улучшения последнего показателя, в частности, предлагается использовать мультисенсорную систему, состоящую из ряда биочипов. Для получения определенной "емкости" надежных данных производится расчет необходимого числа таких датчиков. Однако в целом так называемые метрологические характеристики биосенсоров вполне приемлемы. Относительное стандартное отклонение определяемой концентрации не хуже 10-12 %, притом что нижняя граница определяемых содержаний достигает 10-10-10-15 моль/л. Некоторые биосенсоры работают по принципу да-нет, что вполне приемлемо, когда решается вопрос о присутствии ультрамалых количеств высокотоксичных веществ в объектах окружающей среды. Если определяемые компоненты находятся в сложной смеси или матрице или же близки по своим свойствам, то при анализе используют хроматографические методы разделения. Контроль за разделением осуществляют с помощью системы детекторов на основе биосенсоров. И здесь получены поразительные результаты: разделяют и количественно определяют оптические активные изомеры, различные сахара (лактозу, фруктозу, глюкозу и т.д.), сложные по структуре биологически активные соединения и т.п.