Стерилизация питательных сред, способы культивирования, выделение, очистка и концентрирование продуктов метаболита

 

Доклад  на тему: «Стерилизация  питательных сред, способы культивирования, выделение, очистка  и концентрирование продуктов метаболита».

Душукеновой Бахытгуль, Бт-34  

Стерилизация - полное уничтожение микроорганизмов и их покоящихся форм (например, спор). Существуют разные методы стерилизации: с помощью влажного пара, сухого пара, облучения ультрафиолетовыми лучами, обработки химическими веществами и микрофильтрации.  
Стерилизация питательных сред. Автоклавирование питательных сред для выращивания культур тканей проводят после их разлива в пробирки или колбы под давлением 0.7-0.8 атм. при температуре 115-120^оС в течение 15 - 30 минут, в зависимости от объема среды. Если в результате стерилизации среда помутнела, следовательно, неправильно выбран режим стерилизации.  
При выделении микроорганизмов и сохранении чистых культур необходимо, чтобы среда не содержала никаких посторонних микробов, что достигается обеспложиванием или стерилизацией. Стерилизуют как среды, так и материалы, инструменты, аппараты, которыми пользуются при работе.

Стерилизация  бывает:

 - физическая

 - химическая

Физическая  стерилизация подразделяется на термическую  и холодную. Термическая стерилизация - стерилизация под действием высоких температур, вызывающих денатурацию клеточных белков, разрушающих осмотический барьер клеток, нарушающих равновесие ферментативных реакций, что приводит к гибели клетки. Термическая стерилизация осуществляется различными способами:

1. Прокаливание в пламене горелки. Так стерилизуют бактериальные петли, иглы, кончики пинцетов, горлышки колб и пробирок, ватные пробки (кратковременно).

2. Кипячение. Производят в стерилизаторе. Стерилизуют шприцы,

ножницы, скальпели, пинцеты, резиновые перчатки и резиновые пробки.

3. Стерилизация сухим жаром. Осуществляется в сушильных шкафах

 при температуре 160˚С – 2 ч., 165˚С – 1 ч., 180˚С – 40 мин. Горячим воздухом

чаще  всего стерилизуют стеклянную посуду.

4. Стерилизация влажным жаром (текучим паром). Производится в аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Таким образом, стерилизуют питательные среды, свойства которых изменяются при температурах выше 100˚С. Обработку материала текучим паром используют для проведения дробной стерилизации (тиндализации) – трехкратной обработки питательной среды влажным жаром в течение одного часа при температуре 70 – 80˚С интервалами 24 ч., во время которых поддерживается температура, благоприятная для прорастания спор. Проросшие из спор вегетативные клетки быстро погибают при очередном нагревании.

5. Стерилизация влажным жаром под давлением (автоклавирование). Наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации питательных сред. Основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Время стерилизации 10 – 45 мин. Температура пара возрастает при повышении его давления: 

 Температура пара (˚С)                                (Давление (атм.)

       112                                                0,5

        121                                                 1

        128                                                1,5

        132                                                 2

      6. Неполная стерилизация (пастеризация). Достигается выдерживанием материала при 60˚С в течение 30 мин, при 75˚С –15 мин, при 90˚С без выдержки. Широко применяется для частичной стерилизации легко портящихся пищевых    продуктов (молоко, соки, сиропы). В почвенной  микробиологии пастеризуют суспензии почв, чтобы освободить их от вегетативных клеток, но сохранить споры бактерий. Методы холодной стерилизации применяют в тех случаях, когда среды выдерживают нагревание. Холодная стерилизация включает в себя:

1. Фильтрацию, которая заключается в пропускании жидкостей через специальные фильтры, имеющие мелкопористые перегородки  и поэтому задерживающие клетки микроорганизмов. Причем здесь имеет место не только механическая   задержка, но и адсорбция микроорганизмов на стенках, ограничивающих поры, вследствие того, что большинство микроорганизмов в водных суспензиях несет на своей поверхности отрицательный заряд, а фильтры изготавливаются из положительно заряженных материалов. Диаметр пор определяет область применения фильтров (фильтрующее и стерилизующее действие). Используют следующие типы фильтров:

          • Мембранные фильтры (пористые диски из целлюлозы, коллодия,

ацетата, толщиной около 0,1 мм с диаметром пор от 0, 35 до 1, 2 мкм).

          • Фильтры Зейтца (диски из смеси асбеста с целлюлозой). С

увеличением содержания целлюлозы пористость фильтра  возрастает.

          • Мелкопористые стеклянные фильтры (диски из фрагментов стекла,

получаемые путем его сплавливания).

          • Фарфоровые фильтры в виде полых свечей из каолина с примесью

кварцевого  песка (свечи Шамберлана), из инфузорной земли (свечи Беркефельда)

и других материалов.

  Фильтр, представляющий собой диск, закрепляется в специальном держателе (стеклянном, металлическом), который вставляется в приемник фильтрата (колба Бунзена). Свечи вставляют непосредственно в резиновую пробку приемника. Перед употреблением фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы. Обычно фильтрование ускоряется путем создания на фильтре перепада давления, достигаемого либо приложением повышенного давления к находящейся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного

насоса, присоединенного к приемнику  фильтрата. Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразовое использование. Свечи после специальной обработки можно использовать повторно.

2. Стерилизацию облучением, основанную на летальном эффекте, которое оказывают на клетки микроорганизмов ультрафиолетовые, рентгеновские,γ -, α -, β - лучи и нейтроны. В лабораторных условиях обычно используют ультрафиолетовые лучи, источником которых являются специальные бактерицидные      лампы. Излучателем в них служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления и испускающая линейчатый спектр в ультрафиолетовой области с длиной волны 260 нм. Бактерицидные лампы используют для частичной стерилизации открытых поверхностей и воздуха. Применение ультрафиолета      ограничено из-за его малой проникающей способности. Вегетативные формы бактерий более чувствительны к УФ-облучению, чем споры.

3. Стерилизацию ультразвуком, создаваемым в жидкостях при помощи вибрирующих никелевых или кварцевых дисков. Разрушение клеток при ультразвуковом воздействии обусловлено возникновением вторичных явлений – кавитации. В результате действия звуковой волны высокой частоты образуются разрывы в жидкости, которые затем образуют пузырьки. При их захлопывании идет сильная гидравлическая волна, достигающая 10 атм., что приводит к механическому разрушению клеток. Бактерицидный эффект ультразвука снижается, если подавляется кавитация (разрыв жидкости), что происходит при дегазации, погружении объекта в гель или другую вязкую среду. Бактерицидный эффект     ультразвука напротив усиливается при насыщении озвучиваемой эмульсии     углекислотой, азотом, кислородом, воздухом, так как это усиливает кавитацию. К ультразвуку чувствительны все микроорганизмы, в том числе и споровые. Но по степени чувствительности они значительно отличаются. Химическая стерилизация        представляет собой удаление или разрушение микроорганизмов, находящихся     на неживых объектах или поверхностях, с помощью химических агентов,   получивших название дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих агентов применят галогены и их производные (гипохлорид натрия, хлорамины, спиртовой раствор йода), фенольные соединения, спирты, микробоцидные газы (формальдегид, окись этилена). Для консервации питательных сред, вакцин и сывороток используют хлороформ, толуол, эфир, формалин и др.

Способы культивирования.

Процессы  ферментации в зависимости от используемых групп микроорганизмов (бактерии, актиномицеты, мицелиальные грибы), получаемого продукта (микробная биомасса или их метаболиты), различаются по технологии, динамике, аппаратному оформлению на следующие варианты:

- периодическая,  непрерывная

- глубинная  и поверхностная, жидко- и твердофазовая;

- аэробная  и анаэробная ферментация.

При периодической ферментации в предварительно простерилизованный биореактор в герметичных условиях загружается гомогонезированная, подготовленная по компонентному составу стерильная питательная среда и посевной материал. Устанавливается рН, температура, при необходимости дозированная аэрация и перемешивание. По завершении процесса ферментации биомасса выгружается из биореактора. Ферментер вновь подготавливается к работе, стерилизуется и процесс повторяется.

При непрерывной ферментации свежая питательная среда непрерывно с определенной скоростью поступает в биореактор и такой же объем культуральной жидкости или биомассы непрерывно удаляются из аппарата. Концентрация микробных клеток, компонентов субстрата, удельная скорость роста продуцента постоянна, в отличие от периодической ферментации.

Для осуществления  ферментации в аэробных условиях (наращивание биомассы, синтез антибиотиков, аминокислот, ферментов и т.д.) необходимо обеспечить интенсивную аэрацию и перемешивание культуральной жидкости, соблюдение строго асептических условий, своевременное гашение обильного пенообразования.

Ферментация в анаэробных условиях проводится при получении этанола, вин, органических кислот, пива и других процессах брожения.

Культивирование продуцентов можно вести поверхностно и глубинным методом.

Глубинным методом выращивают микроорганизмы в жидкой питательной среде, и этим методом можно вырастить как аэробные, так и анаэробные культуры. Глубинное культивирование осуществляется в биореакторах, в асептических условиях, чаще при интенсивном аэрировании среды. Массообмен происходит в трехфазовой системе: жидкость – твердая взвесь (микробные клетки) – газ.

Поверхностным методом можно вырастить аэробную культуру микроорганизмов, в основном на твердой питательной среде, редко на жидкой. Поверхностный способ ферментации на жидких субстратах реализуют в кюветах со средой, помещенных в вентилируемые воздухом камеры. Культура потребляет кислород непосредственно из газовой фазы – воздуха, массообмен малоинтенсивный.

Твердофазовая ферментация чаще используется при культивировании мицелиальных грибов. 

Выделение и очистка продуктов  метаболита. После внесения культуры в питательную среду наблюдается лаг-фаза, когда видимого роста микроорганизмов не происходит; этот период можно рассматривать как время адаптации. Затем скорость роста постепенно увеличивается, достигая постоянной, максимальной для данных условий величины; такой период максимального роста называется экспоненциальной, или логарифмической, фазой. Постепенно рост замедляется, и наступает т.н. стационарная фаза. Далее число жизнеспособных клеток уменьшается, и рост останавливается. Следуя описанной выше кинетике, можно проследить за образованием метаболитов на разных этапах. В логарифмической фазе образуются продукты, жизненно важные для роста микроорганизмов: аминокислоты, нуклеотиды, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д. Их называют первичными метаболитами.  Многие первичные метаболиты представляют значительную ценность. Так, глутаминовая кислота (точнее, ее натриевая соль) входит в состав многих пищевых продуктов; лизин используется как пищевая добавка; фенилаланин является предшественником заменителя сахара аспартама. Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей. Поэтому задача промышленных микробиологов состоит в создании мутантных форм микроорганизмов – сверхпродуцентов соответствующих веществ. В этой области достигнуты значительные успехи: например, удалось получить микроорганизмы, которые синтезируют аминокислоты вплоть до концентрации 100 г/л (для сравнения – организмы дикого типа накапливают аминокислоты в количествах, исчисляемых миллиграммами). В фазе замедления роста и в стационарной фазе некоторые микроорганизмы синтезируют вещества, не образующиеся в логарифмической фазе и не играющие явной роли в метаболизме. Эти вещества называют вторичными метаболитами. Их синтезируют не все микроорганизмы, а в основном нитчатые бактерии, грибы и спорообразующие бактерии. Таким образом, продуценты первичных и вторичных метаболитов относятся к разным таксономическим группам. Если вопрос о физиологической роли вторичных метаболитов в клетках-продуцентах был предметом серьезных дискуссий, то их промышленное получение представляет несомненный интерес, так как эти метаболиты являются биологически активными веществами: одни из них обладают антимикробной активностью, другие являются специфическими ингибиторами ферментов, третьи – ростовыми факторами, многие обладают фармакологической активностью. Получение такого рода веществ послужило основой для создания целого ряда отраслей микробиологической промышленности. Первым в этом ряду стало производство пенициллина; микробиологический способ получения пенициллина был разработан в 1940-х годах и заложил фундамент современной промышленной биотехнологии.