Сравнительная характеристика питательных сред и условий культивирования микроорганизмов и растительных клеток

    Методика реактивации существенно отражается на выживаемости

клеток и  должна разрабатываться для каждой культуры отдельно.

    Часто  при переходе от лабораторных  условий к культивированию в

промышленных  масштабах происходит утрата свойств  продуцентов.

    Получение чистой культуры можно осуществлять в лабораторном ферментаторе периодического или непрерывного действия.

 

 

Культивирование микроорганизмов  в промышленных условиях.

 

    На биотехнологических  предприятиях для получения микробной биомассы, а также для производства веществ, продуцируемых микроорганизмами, используют стальные резервуары, служащие «жилищем», «яслями» и «местом работы» микроорганизмов – биореакторы, или

ферментаторы. Процесс культивирования микроорганизмов называют ферментацией.

    Современные  биореакторы появились в результате многолетней исследовательской работы. Решающим толчком для их проектирования послужила «охота за пенициллином». Когда ученые Флори и Чейн искали подходящую емкость для выращивания плесени, то они начали с чашек Петри, где грибы плавали на поверхности питательного раствора.

При культивировании в  плоских емкостях необходимы большие площади. Для получения пенициллина в достаточных для медицины количествах был изобретен биореактор. В настоящее время в биореакторах

выращивают плесени, дрожжи, бактерии, водоросли. В каждом отдельном случае конструкция биореактора рассчитана именно на получениеданного продукта. Например, если надо получить большие количества

дрожжей, используемых как кормовая добавка, то строят гигантские биореакторы размерами с многоэтажный дом и вместимостью до 1500 м3;

цилиндрические  резервуары для производства дрожжей из нефти достигают примерно 40 м в высоту и 20 м в ширину. В пенициллиновом производстве биореакторы имеют меньшие размеры, их вместимость не более 100 м3. Для научно-исследовательской работы в лабораториях

испытывают  мини-реакторы вместимостью несколько  литров.

     Для хорошего «самочувствия»  микроорганизмов важное значение имеет температура питательного раствора. Для большинства микроорганизмов оптимальная температура составляет 20–50ºС. Таким образом, наиболее высокая продуктивность попадает в диапазон от нормальной

до «тропических»  температур.

     В химической промышленности, наоборот, при производстве различных веществ требуются очень высокие температуры, в сотни градусов Цельсия. Для достижения таких температур приходится сжигать гигантские количества топлива (угля, нефти, газа). Это дорого. Чаще всего для биотехнологических процессов требуется даже охлаждение, так как плесени и многие микроорганизмы при потреблении питательных веществ выделяют тепло. Поэтому во избежание смертельного для

микроорганизмов перегрева стенки биореакторов охлаждают  водой.

     Для ускорения превращения веществ  в химических производствах нередко требуются высокие давления. Микроорганизмы действуют при нормальном давлении.

     Рост культуры можно охарактеризовать временем удвоения количества клеток или биомассы. Однако эти величины могут различаться, так как биомасса может увеличиваться и без деления клеток. Рост числа

клеток, биомассы сопровождается изменением содержания биополимеров в биомассе, в частности ДНК, РНК. Если в данных условиях культивирования время удвоения биомассы и числа клеток не различается,значит, рост культуры происходит согласно экспоненциальной зависимости:

 

                    dx / dt = ёx, или dN / dt = ёN,

 

где N – количество клеток в 1 дм3 среды;

     x – концентрация биомассы, г/дм3;

     ё – удельная скорость роста, 1/ч.

 

    Посевной  материал, попав в свежую полноценную  среду, начинает размножаться не сразу. Только после определенного времени, иногда через несколько часов, клетки приспосабливаются к окружающей среде. В биореакторе создаются оптимальные температурные условия, оптимальная концентрация кислорода и оптимальная кислотность среды.

Условия контролируют и с помощью чувствительных датчиков. Профильтрованный стерильный воздух продувается через стерильный питательный раствор, который непрерывно перемешивается. Все отверстия

биореактора, через которые возможно проникновение чужеродных микроорганизмов, стерилизуются водяным паром. По окончании процесса весь питательный раствор с микроорганизмами и образовавшимися

продуктами  сливают, затем продукты отделяют и  очищают.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Культивирование растительных клеток.

 

 

 

Компоненты  среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить  на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных  маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.

Основой для  всех питательных сред для культивирования  растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Мg⁺⁺. Железо используется в виде хелатов [FeО₄ или Fe₂O₄ + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Cl ^–, Н ⁺ необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника  углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании  гетеротрофных тканей (каллусов и  суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В₁, В₆, В₁₂), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.

Тиамин (В₁) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы.

Пиридоксин (В₆) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.

Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н⁺ (отнятие Н⁺ от молекул органических веществ).

Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.

Ауксины: ИУК  – b-индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-мас-ляная кислота, НУК – a-нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфенокси-уксусная кислота.

Цитокинины: кинетин  – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.

Гиббереллины: гиберрелловая кислота.

В качестве биологических  добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.

В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агар-агара  – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P₁₀ и P₂₀₀.

Для искусственных  питательных сред растворы макро- и  микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4^оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20^оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).

Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие  по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно  перед работой со средами.

Для приготовления  маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном  стаканчике при нагревании, затем  сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.

Концентрированные растворы витаминов готовят следующим  образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.

Фитогормоны –  это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1 н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).

 

 

Питательные среды  для растительных биотехнологических объектов.

 

 

Успех в культивировании  объектов зависит от правильного  выбора питательной среды и тщательности её приготовления. В состав питательных  сред входят макро- и микроэлементы (N, P, K, Ca, S, Mg, Fe, B, Zn, Cu, Co, Mn, J, Mo); витамины В₁, В₆, В₁₂, РР и другие; углеводы (сахароза, глюкоза, маннит); фитогормоны (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, цитокинины индуцируют деление дедифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей.  
На средах без гормонов растут “привыкшие” и опухолевые ткани.  
Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов.  
Для индукции каллусогенеза используют более высокие концентрации ауксинов, в дальнейшем ткань может расти при более низком содержании ауксинов.  
В качестве цитокининов состав некоторых сред входит аденин. Иногда используют гибберелловую кислоту (ГК). В качестве ростактиваторов применяют также кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др.  
Состав питательных сред для культивирования биотехнологических объектов зависит от типа их питания:  
- среда без глюкозы - для хлореллы, цианобактерий;  
- среда без витаминов и гормонов - для грибов (фузариума, ботритиса) и для ряски (Lemna);  
- среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами - для культивирования клеток и тканей высших растений.  
Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др..

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВЫВОДЫ.

 

 

1.Правильный подбор и использование питательных сред обеспечивает успешное культивирование микроорганизмов   для накопления биомассы и её биотехнологическое использование для производства диагностических и вакцинных препаратов, определения и идентификации микробов в диагностической лаборатории и научных исследованиях.  
2.культивирование растительных клеток менее капризно, чем культивирование микроорганизмов и проще в своем исполнении. 
3.Состав среды и оптимальные режимы культивирования микроорганизмов определяют двумя способами: длинным многостадийным эмпирическим подбором и использованием математических методов планирования эксперимента. Первый способ является самым распространенным в настоящее время.

4. Наиболее распространенный способ поддержания жизнедеятельности культур клеток микроорганизмов – периодические пересевы продуцента на свежие питательные среды(избежание спонтанных мутаций).

5.Применение культивирования растительных клеток раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях. Клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотепотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. при решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения значительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.