Грибы рода Penicillium

     Систематическое положение 

     Надцарство  –эукариот, царство - грибы

     Семейство Mucedinaceae. Класс несовершенные грибы.  
Среди широко распространенных в природе грибов наибольшее значение для лечебных целей имеют зеленые кистевидные плесени, относящиеся к роду пенициллов Penicillium, многие виды которого способны образовывать пенициллин. Для производства пенициллина используется пенициллин золотистый. Это гриб микроскопических размеров с перегородчатым разветвленным мицелием, составляющим грибницу.

     Морфология.

     Грибы являются эукариотами и относятся  к бесхлорофильным низшим растениям. Они отличаются как своим более  сложным строением, так и более  совершенными способами размножения.

     Как уже было указано, грибы представлены как одноклеточными, так и многоклеточными микроорганизмами. К одноклеточным грибам относят дрожжи и дрожжеподобные клетки неправильной формы, значительно крупнее по размерам бактерий. Многоклеточные грибы-микроорганизмы - это плесневые, или мицелярные грибы.

     Тело  многоклеточного гриба называют талом, или мицелием. Основу мицелия составляет гифа - многоядерная нитевидная клетка. Мицелий может быть септированный (гифы разделены перегородками и имеют общую оболочку). Тканевые формы дрожжей могут быть представлены псевдомицелием, его образование - результат почкования одноклеточных грибов без отхождения дочерних клеток. Общую оболочку псевдомицелий в отличие от истинного не имеет.         

     Мицелий пенициллов в общих чертах не отличается от мицелия аспергиллов. Он бесцветный, многоклетный, ветвящийся. Основное различие между этими двумя близкими родами заключается в строении конидиального аппарата. У пенициллов он более разнообразен и представляет собой в верхней части кисточку различной степени сложности (отсюда его синоним «кистевик»). На основе строения кисточки и некоторых других признаков (морфологических и культуральных) в пределах рода установлены секции, подсекции и серии(рис.1) 

     Рис. 1 Секции, подсекции и серии[4]. 

     Самые простые конидиеносцы у пенициллов несут на верхнем конце только пучок фиалид, образующих цепочки конидий, развивающихся базипетально, как у аспергиллов. Такие конидиеносцы называют одномутовчатыми или моновертициллятными (секция Monoverticillata, . Более сложная кисточка состоит из метул, т. е. более или менее длинных клеток, расположенных на вершине конидиеносца, а на каждой из них находится по пучку, или мутовке, фиалид. При этом метулы могут быть или в виде симметричного пучка или в небольшом количестве и тогда одна из них как бы продолжает основную ось конидиеносца, а другие располагаются на нем не симметрично .В первом случае они называются симметричными (секция Biverticillata-symmetrica), во втором — асимметричными (секция Аэутmetrica). Асимметричные конидиеносцы могут иметь еще более сложное строение: метулы тогда отходят от так называемых веточек . И наконец, у немногих видов как веточки, так и метулы могут быть расположены не в один «этаж», а в два, три и больше. Тогда кисточка оказывается как бы многоэтажной, или многомутовчатой (секция Polyverticillata). У некоторых видов конидиеносцы объединяются в пучки — коремии, особенно хорошо развитые в подсекции Asymmetrica-Fasciculata. Когда коремии преобладают в колонии, их можно видеть невооруженным глазом. Иногда они бывают высотой 1 см и больше. Если в колонии коремии слабо выражены, то она имеет мучнистую или зернистую поверхность, чаще всего в краевой зоне.         

     Детали  строения конидиеносцев (гладкие они  или шиповатые, бесцветные или окрашенные), размеры их частей могут быть различны в разных сериях и у разных видов, так же как форма, строение оболочки и размеры зрелых конидий (рис.2)

     Рис. 2 форма, строение оболочки и размеры зрелых конидий [4].   

Так же как у  аспергиллов, у некоторых пенициллов имеется высшее спороношение — сумчатое (половое). Сумки так же развиваются в нлейстотециях, похожих на клейстотеции аспергиллов. Эти плодовые тела были впервые изображены в работе О. Брефельдом (1874).          

     Интересно, что у пенициллов существует та же закономерность, которая отмечена для  аспергиллов, а именно: чем проще  строение конидиеносного аппарата (кисточки), тем у большего числа видов мы находим клейстотеции. Таким образом, чаще всего они обнаруживаются в секциях Monoverticillata и Biverticillata-Symmetrica. Чем сложнее кисточка, тем меньше в этой группе встречается видов с клейстотециями. Так, в подсекции Asymmetrica-Fasciculata, характеризующейся особенно мощными конидиеносцами, объединенными в коремии, нет ни одного вида с клейтотециями. Из этого можно заключить, что эволюция пенициллов шла в направлении усложнения конидиеносного аппарата, возрастающей продукции конидий и угасания полового размножения. По этому поводу можно высказать некоторые соображения. Так как у пенициллов, как и у аспергиллов, имеется гетерокариозис и парасексуальный цикл, то эти особенности представляют собой ту базу, на основе которой могут возникать новые формы, приспосабливающиеся к разным экологическим условиям и способные завоевать новые жизненные пространства для особей вида и обеспечивать его процветание. В соединении с тем огромным количеством конидий, которые возникают на сложном конидиеносце (оно измеряется десятками тысяч), в то время как в сумках и в нлейстотециях в целом количество спор несоизмеримо меньше, общая продукция этих новых форм может быть очень велика. Таким образом, наличие парасексуального цикла и эффективного образования конидий, по существу, обеспечивает грибам ту выгоду, которую другим организмам доставляет половой процесс по сравнению с бесполым или вегетативным размножением.         

     В колониях многих пенициллов, как у аспергиллов, имеются склероции, служащие, по-видимому, для перенесения неблагоприятных условий.         

     Таким образом, в морфологии, онтогенезе и  других особенностях аспергиллов и  пенициллов имеется очень много  общего, что позволяет предполагать их филогенетическую близость. Некоторые пенициллы из секции Monoverticillata имеют сильно расширенную верхушку конидиеносца, напоминающую вздутие конидиеносца аспергиллов, и, как аспергиллы, встречаются чаще в южных широтах. Поэтому можно представить себе отношения между этими двумя родами и эволюцию в пределах этих родов следующим образом[6]: 

     Структурной основой пенициллинов служит 6-аминопенициллановая  кислота. При расщеплении b-лактамного кольца бактериальными b-лактамазами образуется неактивная пенициллановая кислота, не обладающая антибактериальными свойствами Различия в биологических свойствах пенициллинов определяют радикалы у аминогруппы 6-аминопенициллановой кислоты.

     . Поглощение антибиотиков клетками  микробов.

     Первый  этап во взаимодействии микроорганизмов с антибиотиками - адсорбция его клетками. Пасынский и Косторская (1947) впервые установили, что одна клетка Staphylococcus aureus поглощает примерно 1 000 молекул пенициллина. В последующих исследованиях эти расчеты были подтверждены. 
Так, по данным Мааса и Джонсона (1949), приблизительно 2(10-9 М пенициллина поглощается 1 мл стафилококков, причем около 750 молекул этого антибиотика необратимо связываются одной клеткой микроорганизма без видимого эффекта на ее рост.

     Игл с сотрудниками (1955) определил, что при связывании бактериальной клеткой 1 200 молекул пенициллина угнетения роста бактерий не наблюдается. 
Угнетение роста микроорганизма на 90 % наблюдается в тех случаях, когда клеткой будет связано от 1 500 до 1 700 молекул пенициллина, а при поглощении до 2 400 молекул на клетку происходит быстрая гибель культуры.

     Установлено, что процесс адсорбции пенициллина  не зависит от концентрации антибиотика  в среде. При низких концентрациях  препарата 
(порядка 0,03 мкг/мл) он может весь адсорбироваться клетками, и дальнейшее повышение концентрации вещества не поведет к повышению количества связанного антибиотика.

     Имеются данные (Купер, 1954) о том, что фенол  препятствует поглощению пенициллина  клетками бактерий, однако он не обладает способностью освобождать клетки от антибиотика.

     Пенициллин, стрептомицин, грамицидин С, эритрин  и другие антибиотики связываются  различными бактериями в заметных количествах. Причем антибиотики-полипептиды адсорбируются  микробными клетками в большей степени, чем, например, пенициллины и стрептомицин.

     Рис. 3. Строение пенициллинов: 63 — бензилпенициллин (G); 64 — n-оксибензилпенициллин  (X); 65 — 2-пентенилпенициллин (F); 66 — п-амилпенициллин (дигидро F)6;  67 — п-гептилпенициллин (K); 68 — феноксиметилпенициллин (V); 69 — аллилмеркаптометилпенициллин (O);  70 — α-феноксиэтилпенициллин (фенетициллин); 71 — α-феноксипропилпенициллин (пропициллин);  72 — α-феноксибензилпенициллин (фенбенициллин); 73 — 2,6-диметоксифенилпенициллин (метициллин);  74 — 5-метил-3-фенил-4-изооксиазолилпенициллин (оксациллин); 75 — 2-этокси-1-нафтилпенициллин (нафциллин);  76 — 2-бифенилилпенициллин (дифенициллин); 77 — 3-О-хлорфенил-5-метил-4-изооксазолиль (клоксациллин);  78 — α-D-(–)-аминобензилпенициллин (ампициллин)[6].

     Пенициллины связано образование у бактерий так называемых L-форм; см. Формы бактерий.) Некоторые микробы (например, стафилококки) образуют фермент пенициллиназу, которая инактивирует Пенициллины, разрывая b-лактамное кольцо. Число таких устойчивых к действию Пенициллины микробов в связи с широким применением Пенициллины увеличивается (так, около 80% штаммов патогенных стафилококков, выделенных от больных, устойчивы к БП). 
 
  После выделения в 1959 из . chrysogenum 6-АПК появилась возможность синтеза новых Пенициллины путем присоединения различных радикалов к свободной аминогруппе. Известно свыше 15 000 полусинтетических Пенициллины (ПСП), однако лишь немногие из них превосходят ПП по биологическим свойствам. Некоторые ПСП (метициллин, оксациллин и др.) не разрушаются пенициллиназой и поэтому действуют на устойчивые к БП стафилококки, другие - устойчивы в кислой среде и могут поэтому, в отличие от большинства ПП, применяться внутрь (фенетициллин, пропициллин). Имеются ПСП с более широким, чем у БП, спектром антимикробного действия (ампициллин, карбенициллин). Ампициллин и оксациллин, кроме того, кислотоустойчивы и хорошо всасываются в желудочно-кишечном тракте. Все Пенициллины малотоксичны, однако у некоторых больных с повышенной чувствительностью к Пенициллины они могут вызывать побочные явления - аллергические реакции (крапивница, отек лица, боли в суставах и т.д.). 

Пенициллы по праву  занимают первое место по распространению  среди гифомицетов. Естественный резервуар  их — почва, причем они, будучи в большинстве видов космополитами, в отличие от аспергиллов, приурочены больше к почвам северных широт.

     Особенности жизнедеятельности.

     Размножение.

     Условия культивирования. В качестве единственного источника углерода среды лучшим соединением для биосинтеза пенициллина признана лактоза, т. к. она утилизируется грибом медленнее, чем, например, глюкоза, в результате чего в период максимального образования антибиотика лактоза еще содержится в среде. Лактозу можно заменить легко усваиваемыми углеводами (глюкозой, сахарозой, галактозой, ксилозой) при условии их непрерывного введения в среду. При непрерывном введении в среду глюкозы (0,032 масс. % / ч) выход пенициллина на кукурузной среде повышается по сравнению с использованием лактозы на 15 %, а на синтетической среде — на 65 %.

     Некоторые органические соединения (этанол, ненасыщенные жирные кислоты, молочная и лимонная кислоты) усиливают биосинтез пенициллина.

     Важную  роль в процессе биосинтеза играет сера. Продуценты антибиотика в качестве серы хорошо используют сульфаты и тиосульфаты.

     В качестве источников фосфора P. chrysogenum может использовать как фосфаты, так и фитаты (соли инозитфосфорных кислот).

     Большое значение для образования пенициллина  имеет аэрация культуры; максимальное его накопление происходит при интенсивности аэрации, близкой к единице. Уменьшение интенсивности аэрации или ее чрезмерное увеличение снижает выход антибиотика. Повышение интенсивности перемешивания также способствует ускорению биосинтеза.

     Таким образом, высокий выход пенициллина получают при следующих условиях развития гриба; хороший рост мицелия, достаточное обеспечение культуры питательными веществами и кислородом, оптимальная температура (в период первой фазы 30 °С, в период второй фазы 20 °С), уровень рН = 7,0÷8,0, медленное потребление углеводов, подходящий предшественник.

     Для промышленного производства антибиотика  используют среду следующего состава, %: кукурузный экстракт (СВ) — 0,3; гидрол — 0,5; лактоза — 0,3; NH₄NO₃ — 0,125; Na₂SO₃ × 5H₂O — 0,1; Na₂SO₄ × 10H₂O — 0,05; MgSO₄ × 7H₂O — 0,025; MnSO₄ × 5H₂O — 0,002; ZnSO₄ — 0,02; KH₂PO₄ — 0,2; CaCO₃ — 0,3; фенилуксусная кислота — 0,1.

     Довольно  часто используют сахарозу или смесь  лактозы с глюкозой в отношении 1 : 1. В ряде случаев вместо кукурузного экстракта применяют арахисовую муку, жмыхи, муку из хлопковых семян и другие растительные материалы. 

      Дыхание.

     По  типу дыхания в окружающей среде  грибы аэробы, их тканевые формы (при  попадании в макроорганизм) - факультативные анаэробы.

     Дыхание сопровождается значительным выделением тепла. Особенно энергично выделяется тепло при дыхании грибов и бактерий. На этом свойстве основано использование навоза в парниках в качестве биотоплива. У некоторых растений в процессе дыхания температура повышается на несколько градусов относительно температуры окружающего воздуха.

     Большая часть бактерий использует в процессе дыхания свободный кислород. Такие  микроорганизмы получили название аэробных (от аег — воздух). Аэроб-н ы  и тип дыхания характеризуется  тем, что окисление органических соединений происходит при участии кислорода воздуха с освобождением большого количества калорий. Молекулярный кислород выполняет роль акцептора водорода, образующегося при аэробном расщеплении этих соединений. 
Примером может служить окисление глюкозы в аэробных условиях, которое приводит к выделению большого количества энергии: 
СвН12Ов + 602—*6С02+6Н20 + 688,5 ккал. 
Процесс анаэробного дыхания микробов заключается в том, что бактерии получают энергию при окислительно-восстановительных реакциях, при которых акцептором водорода является не кислород, а неорганические соединения — нитрат или сульфат.