Биотехнология

Таким образом, с учетом сложности генома животных, а также наличия взаимодействия генов в ряде случаев эффект вставки гена будет проявляться не в чистом виде, а сопровождаться другим, иногда не контролируемым пока изменением генома.

По-видимому, огромную роль здесь может играть и так называемый эффект положения гена, то есть воздействие внедренного гена будет во многом зависеть от его локализации в геноме реципиента.

Имеются данные о том, что вирусы саркомы  Молони у мышей могут быть использованы для инфицирования клеток эмбриональной карциномы, которые способны к самостоятельному размножению, как и клетки эндодермы эмбрионов мышей» в результате чего вирус, находившийся в клетках в большом числе копий, не проявлял своего действия вследствие метилирования.  Однако,  если  ДНК  вводилась  в  дифференцированную , клетку, действие гена проявлялось.

Существуют  и другие, не вирусные, элементы, которые  могут служить носителями при переносе генов. Это так называемые мобильные элементы. В 1983 г. была изолирована и описана ДНК мобильных Р-элементов из дрозофилы. Эти элементы иногда образуют вставки в геноме дрозофилы. Они могут быть вырезаны с большой точностью, после чего мутировавший в результате вставки ген снова начинает проявлять свое действие. При инъекции ДНК предполагаемого Р-элемента задней стороны яиц мух типа М перед самым образованием полярных клеток отмечалась высокая степень мутабельности в отдельном локусе, который контролирует морфологию волосков и щетинок на кутикуле взрослых мух. Появление мутантных линий можно было демонстрировать гибридизацией in situ, при которой проявлялось включение ДНК Р-элемента. Включенные в геном Р-элементы не содержали ДНК дрозофилы, которая присутствовала в оригинальном гибридном материале или в участке плазмиды-носителя pBR 322, что доказывает транспозицию элемента Р в геном. Затем Рубин и Спрадлинг осуществили соединение гена, контролирующего ксантиндегидрогеназу, и инъецировали эту конструкцию в эмбрионы. Взрослые мухи передали своему потомству признак розовой окраски глаз, и таким образом была доказана наследуемость гена. Ученые предложили две модификации ДНК элемента Р для того, чтобы сделать его более пригодным в качестве носителя: включение большого числа сайтов рестрикции в этот элемент и создание аномального Р-элемента, кодирующего транспозазу, но не включаемого в геном. Р-Элементы были использованы для вставки»различных генов в геном дрозофилы, в частности, допа-декарбоксилазы и спиртовой дегидрогеназы. Оба гена проявляли свое действие на соответствующих стадиях развития, причем в тех тканях, в которых этот ген обычно проявляется.

Наиболее  широко для введения генов используется микроинъекция. Весьма совершенным методом, используемым в последнее время для изучения проявления действия генов, является микроинъецирование в пронуклеус зиготы. Впервые инъецирование было проведено на ооцитах лягушки Xenopus laevis, в которые вводили хорошо известную ДНК. В 1975 г. Кол-ман ввел в яйцеклетки и ооциты X. laevis ДНК клонированные гены и наблюдал проявление их действия, чтобы изучить, присутствует ли механизм переноса и в ооцитах, и в яйцеклетках. Установлено, что транскрипция рекомбинантной ДНК происходила в обоих случаях. Было показано, что ооциты X. laevis могут транскрибировать рекомбинантные ДНК вполне эффективно, если ДНК вводится в зародышевый пузырек. В 1981 г. осуществлено инъецирование гена   -глобина кролика в оплодотворенные яйцеклетки X.Laevis.

Генная  инженерия и воспроизводство  животных

К  важнейшим  хозяйственно  ценным   признакам   сельскохозяйственных животных относятся  воспроизводительная  способность, плодовитость.

Совершенно  очевидно, что эти процессы находятся  под строгим генетическим контролем, который осуществляет гормональный статус организма, непосредственно влияющий на показатели воспроизводства. Установлено влияние ряда гормонов (ФСГ и ЛГ) на функцию воспроизводства.

Стало принципиально возможным методами генной инженерии организовать биотехнологическое производство этих гормонов для регуляции и стимуляции функций воспроизводства, осуществления работы по трансплантации ранних эмбрионов. В этой связи представляет интерес изучение гена овец породы бурула, который является геном, прямо влияющим на функцию яичника овцы.

Бурула  — одна из небольшого    числа    мериносовых    пород овец, с  высокой генетической обусловленной способностью к высокой плодовитости. Порода представляет большую ценность в качестве генетического улучшателя (путем скрещивания) овец других мериносовых пород в отношении увеличения (40— 60%) их плодовитости. При традиционной внутрипородной селекции по этому признаку такой эффективности можно достичь примерно в течение 30 лет.

Плодовитость  овец относится к полигенным признакам, на которые оказывают влияние  многие гены.

Высокая плодовитость овец бурула — вероятно, следствие влияния одного гена (F), который воздействует на число овулируемых яйцеклеток из яичника за каждый цикл течки. Этот факт возродил интерес к изучению роли основных генов (оли-гогенов) в развитии количественных признаков животных и к развитию методов их распознавания и использования.

Животные  — носители бурулагена — уже  были использованы для генетического улучшения эффективности воспроизводства овец. Ген F ввели в геном животных других пород овец путем скрещивания и разработали точные математические модели для прогноза возможной эффективности этих программ. Технология рекомбинантной ДНК во многом может упростить этот процесс и сделать возможным пересадку гена F не только в геном овец, но и других видов сельскохозяйственных животных. Поэтому обзор данных о бурулагене представляет большой интерес для практической генной инженерии сельскохозяйственных животных.

Изучение  межлинейных кроссов показало, что  повышение плодовитости — результат  скрещивания бурула с другими  мериносами, а также с различными другими породами овец. Однако не всегда повышение плодовитости можно отнести к эффекту только одного  гена.

Из многих работ, посвященных оценке сравнительной  продуктивности помесей бурула с овцами других пород, только п одной выявлен эффект F-гена на шерстную продуктивность и живую массу тела. В этой работе было показано, что ген не оказывает нежелательных плейотропных действий на настриг шерсти, толщину и длину волокна, массу новорожденных ягнят, живую массу взрослых (15-месячных) овец. Эти данные подтверждают, что принципиальный эффект гена — влияние на плодовитость в результате воздействия на степень овуляции, в частности число потомков овец с генотипом FF, — был в 1,9 раза больше.

Исследования  биологии размножения овец бурула подтвердили, что роль F-reiia направлена на контроль физиологии яичника овец. Установлено, что овцы бурула имеют одинаковое с контрольными мериносами число развивающихся фолликулов. У овец романовской породы в 2 раза больше развивающихся фолликулов, чем у овец других пород. В пределах популяции

бурула (степень овуляции от 3 до 9) не было корреляции между степенью овуляции в предшествующем цикле и числом антральных фолликулов.

Эти данные подтверждают, что яичник овцы бурула имеет отличие в фолликулярных  характеристиках от других плодовитых пород. Стало очевидно, что F-ген не влияет на увеличение числа развивающихся в яичнике фолликулов. Степень ат-резии среди развивающихся фолликулов также влияет на сходство овец с  -геном и не несущих его.

Однако  овцы породы бурула характеризуются  наличием фолликулов, которые имеют значительно меньшие размеры к моменту овуляции, а также тем, что они содержат только 50% числа гранулированных клеток в каждом развивающемся фолликуле; эти морфологические признаки" могут быть отнесены непосредственно к эффекту F-гена.

Различия  в развитии и морфологии фолликулов в такой же степени, по-видимому, обусловливают высокую степень  овуляции у бурула. Было отмечено, что у бурула фолликулы диаметром менее 2 мм появлялись между 13-м и 15-м днями цикла и они достигали овуляционного размера (3—4 мм) на 15-й день. Однако пополнение продолжалось в течение 15—17 дней, и дополнительные фолликулы у бурула достигали овуляционного размера ко времени высвобождения лютеинизирующего гормона (ЛГ). Этого явления не отмечали у романовской породы, и оно характерно только для овец породы бурула.

Таким образом, два генотипа мериносов (то есть бурулаи контроль) начинали лютеолизис с небольшим числом кандидатов (то есть антральных фолликулов) для овуляции. У контрольных мериносов часть «доминантных» фолликулов быстро развиваются, а остальные прекращают развитие и атрезируют. У бурулы дополнительные кандидаты не исключаются, и их развитие до конечной стадии роста фолликулов и овуляции индуцируется повышенной частотой выброса ЛГ.

Время предовуляторного высвобождения ЛГ у плодовитых овец — важный признак. В исследованиях на плодовитых овцах с генотипами, отличающимися от генотипа бурула, было показано, что у них высвобождение ЛГ отмечалось значительно позже после начала течки (и лютеолизиса), чем у овец с низкой плодовитостью. У овец бурула этого не происходит, так как оба генотипа и «С»-мериносы высвобождали ЛГ приблизительно через 4, 5 ч после начала течки. У овец бурула овуляция отмечается в среднем на 7,5 ч раньше после начала течки по сравнению с контролем, несмотря на одинаковое время высвобождения ЛГ. Ген F, по-видимому, делает предовуляци-онные фолликулы более чувствительными к эндогенному ЛГ.

Имеются данные, свидетельствующие о том, что овцы бурула, не достигшие половой зрелости, и взрослые имеют в плазме более высокие концентрации ФСГ, чем контрольные мериносы. Это различие было также подтверждено в отношении гипофиза с помощью метода радиорецептора и радиоиммунного теста.

Можно заключить, что множественная овуляция у овец — результат интенсивной ФСГ-стимуляции яичника в течение поздней лютеиновой и ранней фолликулярной фаз цикла течки.

Активность  яичника овцы бурула, вероятно, не зависит  от концентрации гонадотропина в  плазме, а связана с повышенной чувствительностью к гонадотропину фолликулов этих животных. Это утверждение основано на том, что овца бурула проявляет более высокий овуляторный ответ на гонадотропин СЖК (ГСЖК), чем мериносы, и что овцы с F-геном более чувствительны к ГСЖК, чем овцы без F-гена. Различие в чувствительности было явным начиная с 5-месячного возраста овец. Это может быть основным признаком генотипов плодовитых животных, поскольку генетические связи между плодовитостью и чувствительностью к ГСЖК описаны также у мышей и крупного рогатого скота.

Пока  не установлено — яичник или индивидуальные фолликулы плодовитых пород более чувствительны к ФСГ — гормону, отличающемуся от экзогенного ГСЖК. Такие данные могут быть получены, при исследовании ответа изолированных фолликулов на добавление ФСГ или ответа яичника гипофизэкто-мированных овец на введенный овечий ФСГ. Такие эксперименты проводятся.

Если  фолликулы овцы бурула имеют больше рецепторов к гонадотропину, то они  могут затем больше захватывать  гонадотропина из циркулирующей крови, чем фолликулы других мериносов. Этим можно объяснить различия в чувствительности яичника между генотипами. Приобретение рецепторов к ЛГ на гранулированной оболочке — существенная необходимость для овуляции развивающихся фолликулов овцы. У овец финский ландрас таких фолликулов в фолликулярную фазу больше, чем у овец породы суффольк. Однако нет данных, что плодовитая овца имеет больше рецепторов к ЛГ на каждом фолликуле.

Можно предположить, что добавочные фолликулы, которые развиваются у овец бурула, образованы так в результате наличия у них рецепторов к ФСГ (или большого числа рецепторов к ФСГ), что делает их способными отвечать на этот гонадотропин.

Было  сделано заключение, что фактор яичника, отличный от эстрадиола и прогестерона, должен способствовать регуляции обратной связи ФСГ в течение цикла течки у овец. Фактор яичника,— по-видимому, ингибин, нестероидный гонадный гормон, способный селективно угнетать выделение ФСГ из гипофиза. Несмотря на то что в настоящее время ингибин очищен, данные о его влиянии на плодовитость основаны главным образом на экспериментах с использованием фолликулярной жидкости (ФЖ), свободной от стероидов. Установлено, что в ФЖ имеются другие белковые гормоны, которые могут непосредственно действовать на яичник.

Свободная от стероидов овечья ФЖ способна подавлять течку и овуляцию у бурула и мериносов. Повторяющиеся инъекции овечьей ФЖ в течение 5 дней задерживают овуляцию, по крайней мере, на 12 дней. Частично очищенная овечья ФЖ была эффективна в такой же степени, как и неочищенная овечья ФЖ в подавлении овуляции. Этот эффект, по всей вероятности, результат действия ингибина в овечьей ФЖ, поскольку последняя селективно подавляет ФСГ у овцы.

Доказательство  включения ингибина в действие /-'-гена получено путем измерений его биоактивности у овец бурула и мериносов.

У овец бурула. со средней степенью овуляции 2,8 содержалось '/з ингибина по сравнению с мериносами, у которых было в среднем 1,2 овуляции.