Анықтамалар, қысқартулар мен белгілеулер

     Жұмысты орындау барысында M. Tuberculosis липополисахаридтері мен ультрадыбысты дезинтеграттың препаративті мөлшері алынды. Қанның сарысуынан туберкулезге қарсы антиденені табу үшін микобактерияларды антигендері ИФТ қолдану барысында олардың өзара айырмашылықтары анықталды, бұл препараттың антигендігі мен олар планшеттің қатты фазасында бекітілу дәрежесімен түсіндіріледі [5]. 

2.2.2 Mycobacterium  tuberculosis ультрадыбысты дезинтеграты мен   липополисахаридті антигенінің моноклоналды антиденелерді өндіретін гибридті жасушалар штамдарын алу 

     BALB/c тышқандарын иммундеудің бірінші күні құрсақ ішіне әрбір антигенді 100 мкг мөлшерде, Фрейндтің толымсыз адъювантымен (Gibco, США) тең мөлшерде араластырылып енгізілді. Иммундеудің 7,11, 12, 13 – ші күндері тышқандарға pH 7,2 – 7,4 болатын буферленген физиологиялық ерітіндіде араластыру арқылы 100 мкг антигенді енгіздік. Cоңғы иммундеуден үш күн өткен соң тышқандардың қан сарысуындағы телімді антиденелердің титрлері қатты фазалы иммунды ферментті талдау тәсілімен анықталды. Кесте 1. 

Кесте 1 – Иммунды ферменттік талдаудың жанама тәсілімен BALB/c тышқандарының  қан сарысуында түзілген антиденелер титрін зерттеу нәтижесі

 

     1 – ші кестеден көргеніміздей,  ұқсас антигенге қарсы Mycobacterium tuberculosis УДД – пен иммунделген тышқандардың қан сарысуындағы телімді антиденелер титрі ИФТ – да 1:25600- ге жетті. ЛПС – пен иммунделген тышқандардың қан сарысуындағы антиденелер өз антигенімен 1: 12800 титрде байланысқа түсті. Жоғарыдағы антигендерге қарсы пайда болған антиденелер арасындағы әлсіз қиылысқан реакцияның байқалуы қолданылған препараттар детерминанттарының арасындағы айтарлықтай айырмашылықтың бар екендігін дәлелдейді.

     Сонымен, біз колданған Мусоbасtеrіит tиbесиlоsis УДД антигені мен Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің липополисахаридімен ВАІВ/с тышкандарын иммундеу сызбасы, қолданылған антигенге қарсы антиденелердің жеткілікті мелшерде ілуіне мүмкіндік беріп, тәжірибедегі жануарлар организмнің иммунды жүйесін күшейтуге толығымен жарамды болды. Бұл спецификалық антнденелерді өндіретін В-лимфоциттер клондарының белсенді индукциясын көрсетеді.

     Тышкандардың әрбір антиденелер титрі тобынан максималды болған жануарлар таңдалып алынды, олардың көк бауырлары иммунды лимфоциттердің көзі ретінде колданылды. Тышкандардың лимфоциттерін Х63- Аg 8.6.5.3 линиялы миеломды жасушалармен гибридизациялауды ПЭГ-4000 қатысуымен жүргіздік.

     Гибридомалардың телімді антиденелерді  өндіретіндігін өскен ортаның аздап сарғаюы байқалганда және гибридом жасушалары ұяшық беткейі көлемінің 30%-ын алғанда тестілеуді бастайды.

     Иммунды спленоциттер мен миелома жасушаларын будандастыру нәтижелері 2-ші кестеде көрсетілген.

 

Кесте 2 - Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің ультрадыбысты дезингегратымен егілген ВАІВ/с тышкандардың лимфоциттері мен миелома жасушаларын будандастыру нәтижелері

 

     2-ші кестеден көргеніміздей, будандастырудың  нәтижесінде М. tиbеrсиlоsіs-тің ультрадыбысты дезинтеграты ақуызды антигенімен иммунделген тышқандардың спленоциттері мен миелома жасушаларының гибридизациялау кезінде жақсы көрсеткіш байкалып отыр. Гибридомалардың өсуі 384 себілген барлык ұяшықтың 90-ында байкалды, яғни жасушалардың будандасуы 23,4% кұрады. Липополисахаридті антигенімен иммунделген жануарлар лимфоциттерін колданған жағдайда бұл көрсетіш 60-қа немесе 15,6 %-ға тең болды.

     Жасуша гибридизациясының біз кол жеткізген жоғары дәрежесі ИФТ-да телімді антиденелерді түзуші гибридті клондарды анықтау жұмыстарын бастауға мүмкіндік берді. Гибридомалардың спецификалык антиденелер өндіруін тестілеу тышқандарды иммундеуге қолданылған микобактериалды антигендер көмегімен жүргізілді (3-кесте). 

Кесте 3 - Гибридомалардың өсінді сұйықтығын ИФТ-да тестілеу нәтижелері

 

     3-ші кесте көрсеткіштері бойынша будандастыру нәтижесінде пайда болған 90 гибридоманың 15-і ультрадыбысты дезинтегратының ақуызды антигендеріне телімді антиденелерді синтездейтіндігі байқалса, М. tuberculosis-тің ЛПС антигенімен иммунделген тышкандардың лимфоциттері мен миеломаларын будандастыру нәтижесінде пайда болған 60 гибридті жасушалардың небары 10-нан немесе 16,4%-нан ғана аталмыш антигенге телімді антиденелер анықталып отыр.

     Моноклоналды антиденелерді тұрақты  синтездейтін клондарды іріктеу мақсатында алынған гибридомалардың белсенділігі иммунды ферментті талдау көмегімен арасына 3-4 күн сала отырып бес рет тексерілді (4-кесте). 

Кесте 4 - Гибридті жасушаның  скрининг нәтижелері

 

    4-ші кесте мәліметтері бойынша М tиbегсиlоsіs-тін УДД антигеніне телімді антиденелерді түзетін 15 гибридомалардың барлықтары бес рет тексеру барысында да өз белсенділіктерін сактағандығы айқындалды, 15 гибридома ішінен 1G3, 1Д7 және 2С10 деп аталатын гибридті клондардың синтездейтін антиденелерінің титрі 1:64 болса, қалғандарының түзетін антиденелер титрі 1:64 бен 1:32 шамаларында болды.

     М. tuberculosis-тің ЛПС антигенге қарсы антиденелерді түзетін гибридомалардың барлығын төрт рет тестілеу нәтижесінде 1:2 мен 1:16 аралығындағы титрлерді көрсетсе, бесінші рет тексеру барысында өздерінің антиденелік белсенділіктерін тұтас жоғалтқандығы анықталып отыр.

     Сонымен, әрі қарайғы жұмыстарымызда тұракты антиденелерді түзуші клондарды М. tuberculosis УДД-мен иммунделген тышкандар лимфоциттерінен пайда болған гибридомалар арасынан ғана тандай алдық.

     1Д7, 2С10 және 103 жасушалар клондары  анағұрлым белсенді және тұрақты  гибридомалар лимитті сұйылту  әдісімен клондаудан өткізілді (5-кесте). 

Кесте 5 - Моноклоналды антиденелерді  түзетін гибридома  жасушаларын клондау  нәтижелері

 

     Бұл ретте бастапқы ата-аналық жасушадан гибридомдардың позитивті субклондарының шығуы 67,5%-дан 80,0%-тты құрады. Гибридомалардың алынған субклондарының ішінде микобактериалды антигендер эпитопына туыстас МКА-дің жоғары пролиферативтік белсенділігімен және өнімділігімен сипатталатын әрбір гибридомадан бір клоннан тандалып алынды. Аталмыш гибридомдардың барлық субклондарының өсінді сұйыктығының кұрамындағы моноклоналды антиденелердің титрлері 1:32 - 1:256 шамасында болды.

     Гибридома штамдарының өнімділігі 3-4 тәулік бойы өсірілген гибридомалардың өсінді сұйыктығындағы моноклоналды антиденелердің концентрациясы 125 мкг/мл-ге жетті. Гибридома штаммдарын ВАLВ/с тышқандарының кұрсақ қуысында in vivo жағдайында өсіргенде олардың өнімділігі айтарлыктай жоғары болды. Өйткені, асцитті сұйыктықтағы моноклоналды антиденелердің концентрациялары 4-6 мг/мл-ге дейін жиналды, яғни асцит сұйыктығындағы антиденелер мөлшері дақылдық ортанын супернатантымен салыстырғанда 400-1600 есеге жоғарылап отыр. Сәйкесінше асцит сұйыктығындағы антиденелер титрі де артты. Гибридома жасушаларын криоконсервациялағаннан кейінгі тіршілік ету деңгейі 65-70%-ды кұрады.

     Келесі зерттеуде асцит сұйыктығының  моноклоналды антиденелерінің белсенділігі мен телімділігі Mycobacterium туысына жататын әр түрлі бактерия ангигендерін колдану аркылы иммунды ферменттік талдаудың жанама әдісіне анықталды. (6-кесте). 

Кесте 6 - Моноклоналды антиденелердің белсенділігі мен  телімділігін иммунды ферменттік талдаудың жанама әдісіне тексеру натижесі