Определение чистоты лекарственных средств химическими, физическими и физико-химическими методами анализа

 Степень разделения  веществ в колонке определяется  расстоянием между максимумами  двух соседних пиков и шириной хроматографической полосы. 

 Метод жидкостной  хроматографии обеспечивает достоверные  данные по содержанию интересующего  компонента в смеси. Время выхода  компонента из колонки при  одних и тех же условиях  разделения будет всегда постоянно  и может служить характеристикой данного компонента (качественный анализ), а площадь пика - пропорциональна количеству данного компонента в пробе (количественный анализ).

 Принцип анализа в BЭЖХ. Анализируемую смесь растворяют в подвижной фаза и с помощью дозатора или микрошприца вводят в специальное устройство прибора. Туда же подается под определенным давлением и с определенной скоростью подвижная фаза. По мере продвижения подвижной фазы с растворенными в ней веществами за определенный промежуток времени на колонке происходит разделение смеси. Чем больше сродство компонента к неподвижной фазе и чем меньше к подвижной, тем медленнее он движется по колонке и тем дольше в ней удерживается.

Анализ проводится в  определенном режиме температур, что  создается с помощью устройства для термостатирования.

Обработка полученных результатов  проводится вручную или с помощью  микропроцессорных систем, имеющихся  в структуре приборов. 

ВЭЖХ используется в фармакопейном анализе при определении подлинности, испытании на чистоту и количественном определении лекарственных смесей.

Пример определения  примеси.

Анальгин  (ФС 42-0215-07)Определение примесей методом ВЭЖХ

Буферный  раствор срН 7,0. 6,0 г натрия фосфата однозамещенного растворяют в 1000 мл воды, прибавляют 1 мл триэтиламина и доводят рН раствора 10 % раствором натрия гидроксида до значения 7,0.

Испытуемый  раствор. 0,050 г субстанции растворяют в 10 мл метанола. Раствор анализируют тотчас же.

0,05 % раствор 4-аминоантипирина. 0,010 г 4-аминоантипирина растворяют в 20 мл метанола.

Раствор сравнения. 1 мл 0,05 % раствора 4-аминоантипирина разводят метанолом до 20 мл.

Раствор для проверки пригодности системы. 0,02 г субстанции растворяют в 10 мл метанола и кипятят с обратным холодильником в течение 10 мин, охлаждают и разводят метанолом до 20 мл. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 мл 0,05 % раствора 4-аминоантипирина и перемешивают.

 

Условия хроматографирования

Колонка - 25 х 0,46 см с октадецилсилил силикагелем (С₁₈), 5 мкм;

Подвижная фаза (ПФ) - буферный раствор с рН 7,0 - метанол (72:28);

Скорость  потока - 1,0 мл/мин;

Детектор - спектрофотометрический, 254 нм;

Объем пробы - 10 мкл.

Хроматографируют  раствор для проверки пригодности  системы. На хроматограмме должно наблюдаться 3 пика с относительными временами удерживания 1,0 (анальгин), около 1,4 (4-аминоантипирин) и около 2,0 (4-метиламиноантипирин). Разрешение (К.) между пиками анальгина и 4-аминоантипирина должно быть не менее 2,2; между пиками 4-аминоантипи-рина и 4-метиламиноантипирина - не менее 3,0.

Последовательно хроматографируют раствор сравнения  и испытуемый раствор. Время регистрации  хроматограммы испытуемого раствора должно не менее чем в 1,5 раза превышать время удерживания пика 4-метиламиноантипирина.

На хроматограмме  испытуемого раствора площадь пика 4-метиламиноантипирина должна быть не более площади пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,5 %), площадь пика любой другой примеси должна быть не более 40 % от площади пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,2 %), суммарная площадь пиков примесей должна быть не более площади пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,5 %). Не учитывают пики, площадь которых составляет 5 % и менее от площади пика на хроматограмме раствора сравнения.

Вопросы для  самоконтроля по теме: УФ - спектрофотометрия

1. Дайте обоснование метода.
2. В каком диапазоне длин волн проводят измерение?
3. Как называется прибор для измерения, назовите его основные узлы.
4. На каких законах основан метод? Обоснуйте его?
5. Перечислите основные фотометрические параметры, дайте им обоснование?
6. Для каких целей используется данный метод в фармацевтическом анализе?
7. В чем отличие спектрофотометрии в УФ области от измерения в видимой и ИК области?

Вопросы для  самоконтроля по теме: ТСХ

1. На чем основан метод хроматографирования.
2. Укажите физическую разновидность ТСХ.
3. Какие адсорбенты, закрепители и системы используются при ТСХ?
4. Чем руководствуются при выборе растворителей?
5. Какие пластинки заводского изготовления используют при ТСХ?
6. Как проявляют хроматограммы?
7. Перечислите универсальные проявители, приведите примеры специфических проявителей.
8. По каким показателям судят о наличии и количественном содержании примесей по результатам ТСХ?

        Вопросы для самоконтроля по теме: ВЭЖХ

1. На чем основан метод ВЭЖХ?
2. В чем отличие метода ВЭЖХ от других методов хроматографирования?
3. Как называется прибор для хроматографирования данным методом, перечислите его основные узлы.
4. Для каких целей применяется метод ВЭЖХ в фармацевтическом анализе?
5. По каким показателям судят о наличии и количественном содержании по результатам ВЭЖХ?
6. Какие преимущества и недостатки данного метода?

Литература:

1. Государственная фармакопея СССР. Выпуск 1. 11-е изд., - М.: Медицина,   1987.-С.102-105; С.110-113;
2. Государственная фармакопея РФ.. 12-е изд., -М.: Медицина, 2007.-С.56-61.
3. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. –М.: МЕДпресс-информ,2007.- С.118-120. 
   

П Р И Л О Ж  Е Н И Е

(Общие фармакопейные  статьи из ГФ XI и XII издания и Фармакопейные статьи)…

 

 ИСПЫТАНИЯ НА ЧИСТОТУ И ДОПУСТИМЫЕ ПРЕДЕЛЫ ПРИМЕСЕЙ

(Государственная фармакопея РФ XII издания, С 118.)

Определение примесей в лекарственных средствах  и оценку их содержания проводят путем сравнения с эталонными растворами, устанавливающими предел содержания данной примеси, после проведения реакции. Окраска или опалесценция/муть испытуемого раствора должна быть не интенсивнее окраски или опалесценции/мути эталонного раствора.

Общие замечания (Государственная фармакопея РФ XII издания, С 118.)

 

7. Вода и все реактивы должны быть свободны от ионов, на содержание которых 
   проводят испытания.
8. Пробирки, в которых проводят наблюдения, должны быть бесцветными и одинакового диаметра (около 1,5 см, если не указано иначе).
9. Если не указано иначе, навески для приготовления эталонных растворов отвешивают с точностью до 0,001 г.
10. Наблюдения мути и опалесценции растворов проводят в проходящем светена темном фоне, а окраски - по оси пробирок при дневном отраженном свете наматово-белом фоне.
11. Прибавление реактивов к испытуемому и эталонному растворам должно проводиться одновременно и в одинаковых количествах.
12. В случае, когда в соответствующей фармакопейной статье указано, что в данной концентрации раствора не должно обнаруживаться той или иной примеси, поступают следующим образом. К 10 мл испытуемого раствора прибавляют применяемые для каждой реакции реактивы, указанные в методике, кроме основного реактива, открывающего данную примесь. Затем раствор делят на две равные части: к одной из них прибавляют основной реактив и оба раствора сравнивают между собой. Между ними не должно быть заметной разницы.

 

Определение примесей на хлориды, сульфаты, соли аммония, кальция, цинка, мышьяк проводят по требованию ОФС ГФ XI,   том 1 , стр (166-169, 171, 173-175)

 

                                                       Испытание на хлориды

Растворы хлоридов в  зависимости от их концентрации образуют с раствором нитрата серебра  белый творожистый осадок, белую  муть или опалесценцию, не исчезающие от прибавления азотной кислоты  и легко исчезающие от прибавления раствора аммиака.

Предельная  чувствительность реакции — 0,0001 мг (0,1 мкг) хлор-иона в 1 мл раствора. 0,002 мг (2 мкг) хлор-иона в 1 мл раствора дают при этой реакции хорошо заметную опалесценцию.

Определение проводят следующим  образом: к 10 мл раствора испытуемого препарата, приготовленного, как указано в соответствующей частной статье, прибавляют 0,5 мл азотной кислоты, 0,5 мл раствора нитрата серебра, перемешивают и через 5 мин сравнивают с эталоном, состоящим из 10 мл эталонного раствора Б и такого же количества реактивов, какое прибавлено к испытуемому раствору.

 

 

Опалесценция, появившаяся в испытуемом растворе, не должна превышать эталон.

Эталонный раствор хлор-иона. 0,659 г прокаленного хлорида натрия растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки (раствор Б). Этот раствор содержит 0,002 мг (2 мкг) хлор-иона в 1 мл.

Испытание на сульфаты

Растворы сульфатов в зависимости от их концентрации образуют с растворами солей бария белый осадок или муть, не исчезающие от прибавления разведенной хлористоводородной кислоты.

Предельная чувствительность реакции 0,003 мг (3 мкг) сульфат-иона в 1 мл раствора. 0,01 мг (10 мкг) сульфат-иона в 1 мл раствора дает при этой реакции через 10 мин заметную муть.

Определение проводят следующим  образом: к 10 мл раствора испытуемого  препарата, приготовленного, как указано  в соответствующей частной статье, прибавляют 0,5 мл разведенной хлористоводородной кислоты и 1 мл раствора хлорида бария, перемешивают и через 10 мин сравнивают с эталоном, состоящим из 10 мл эталонного раствора Б и такого же количества реактивов, какое прибавлено к испытуемому раствору.

Муть, появившаяся  в испытуемом растворе, не должна превышать эталон.

Эталонный раствор сульфат-иона. 1,814 г сульфата калия, высушенного при температуре от 100 до 105°С до постоянной массы, растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки (раствор А). 10 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки (раствор Б). Этот раствор содержит 0,01 мг (10 мкг) сульфат-иона в 1 мл.

Испытания на соли аммония

МЕТОД I

Растворы  солей аммония в зависимости от их концентрации образуют с реактивом Несслера желто-бурый осадок или желтое окрашивание.

Предельная чувствительность реакции 0,0003 мг (0,3 мкг) иона аммония  в 1 мл раствора. 0,002 мг (2 мкг) иона аммония  в 1 мл раствора дают при этой реакции  ясное желтое окрашивание.

Определение проводят следующим  образом: к 10 мл раствора испытуемого препарата, приготовленного, как указано в соответствующей частной статье, прибавляют 0,15 мл реактива Несслера, перемешивают и через 5 мин сравнивают с эталоном состоящим из 10 мл эталонного раствора Б и такого же количества реактива, какое прибавлено к испытуемому раствору. Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не должна превышать эталон.

В препаратах, содержащих щелочноземельные и тяжелые металлы, определение проводят следующим образом: испытуемое вещество растворяют в возможно меньшем количестве воды, прибавляют при охлаждении 2 мл раствора едкого натра и 2 мл раствора карбоната натрия.

Раствор разбавляют водой до требуемой концентрации, взбалтывают и фильтруют. В 10 мл фильтрата проводят определение, как указано выше.

В препаратах, содержащих более 0,03% примеси железа, определение  проводят следующим образом: к 10 мл раствора испытуемого препарата  прибавляют. 2 капли раствора едкого натра и 3 мл 20% раствора тартрата натрия-калия. После тщательного перемешивания прибавляют 0,15 мл реактива Несслера и далее поступают, как указано выше.

Эталонный раствор аммоний-иона. 0,628 г хлорида аммония, высушенного в эксикаторе над серной кислотой до постоянной массы, растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки (раствор А). 10 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 1л и доводят объем раствора водой до метки (раствор Б). Этот раствор содержит 0,002 мг (2 мкг) иона аммония в 1 мл.

МЕТОД II

Соли аммония при  прибавлении едкого натра выделяют аммиак, который определяют по запаху или посинению смоченной водой красной лакмусовой бумаги.

Предельная чувствительность реакции 0,003 мг (3 мкг) иона аммония в 1 мл раствора.

Определение проводят следующим образом: 5 мл раствора испытуемого препарата, указанной в соответствующей частной статье концентрации, помещают в коническую колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора едкого натра. Сверху колбы помещают смоченную водой красную лакмусовую бумагу и закрывают часовым стеклом. Колбу ставят на водяную баню.

Наблюдение проводят через 5 мин.