Элементы генной инженерии

20

Содержание

Введение.

Генная инженерия -  направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. Генная инженерия позволяет путем операций в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим.

В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.

.

Что такое ген.

Любое растение или животное имеет тысячи различных признаков. Например, у растений: цвет листьев, величина семян, наличие в плодах определённого витамина и тому подобное. За наличие каждого конкретного признака отвечает определённый ген. Ген - от греческого genos, и переводится как "род", "происхождение". Ген представляет собой маленький отрезочек молекулы ДНК, в котором находится информация о первичной структуре какого-либо одного белка (один ген — один белок). Поскольку в организмах присутствуют десятки тысяч белков, существуют и десятки тысяч генов. Совокупность всех генов клетки составляет ее геном. Все клетки организма содержат одинаковый набор генов, но в каждой из них реализуется различная часть хранимой информации. Поэтому, например, нервные клетки и по структурно-функциональным, и по биологическим особенностям отличаются от клеток печени.

Ген и генерирует или порождает определённый признак растения или животного. Если убрать ген, отвечающий за появление определённого признака, то исчезнет и сам признак. И, наоборот, если добавить, например, растению новый ген, то у растения появится и новый признак. Изменённое же растение может теперь именоваться мутантом (с лат. - изменённый).

Сущность методов генной инженерии заключается в том, что в генотип организма встраиваются или исключаются из него отдельные гены или группы генов. В результате встраивания в генотип ранее отсутствующего гена можно заставить клетку синтезировать белки, которые ранее она не синтезировала.

Открытие двойной структуры ДНК и матричного синтеза.

Начальные работы американских учёных Уотсона и Крика были произведены в 1953 году. Они дали возможность развиваться генной инженерии в качестве самостоятельного раздела науки. Эти открытия заключены в следующем:

Была открыта двойная структура ДНК и постулирован её матричный синтез. Двойная спираль ДНК при репликации разделится и вдоль нити ДНК, специальные ферменты-полимеры, собирают точные копии материнской ДНК, таким образом в клетке перед делением две совершенно одинаковые молекулы ДНК, одна из которых после деления клетки попадает в дочернюю клетку. Таким образом дочерняя клетка несет ту же самую информацию, что и материнская, следовательно выполняет те же самые функции. Итак, в клетках живого организма возможен особый тип реакции – матричный синтез. Одна молекула – матрица, а вторая строится по её программе. репликация ДНК синтез всех видов РНК и сборка молекул белка, в соответствии со структурой и-РНК – это все варианты матричного синтеза, который происходит всегда при участии нуклеиновых кислот.

По тому же самому механизму осуществляется сборка РНК, только не двух спиралей, а одной. Этот процесс получил название – транскрипция. Поток информации в клетке обеспечивает реакции матричного синтеза: репликация ДНК(необходима для передачи наследственной информации дочерним клеткам), транскрипция(синтез и-РНК в ядре клетки) и трансляция(сборка белковой цепи на и-РНК при помощи рибосомы).

Генетическая инженерия

Генетическая инженерия возникла  в 1972 году, в Станфордском университете, в США. Тогда  лаборатория  П.  Берга получила первую рекомбинатную (гибридную)  молекулу ДНК или (рекДНК). Она соединяла  в себе фрагменты ДНК фага лямбда, кишечной палочки и обезьяньего вируса SV40. С этого момента формально и взяла старт генная инженерия. Вживляя ген, "одолженный" у одного растения (или животного) другому, биотехнологи добиваются появления новых видов с определенными заданными свойствами. Гибридная  ДНК  имеет  вид  кольца.  Она

содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК,  обеспечивающий размножение  гибридной  ДНК  и  синтез   конечных   продуктов   деятельности генетической системы - белков. Большая часть  векторов  получена  на  основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40,  полиомы,  дрожжей  и  др.  бактерий. Синтез белков происходит клетке-хозяине. Наиболее часто в  качестве  клетки-хозяина используют  кишечную  палочку,  однако  применяют  и  др.  бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки.  Система  вектор-хозяин  не  может быть произвольной:  вектор  подгоняется  к  клетке-хозяину.  Выбор  вектора

зависит от видовой специфичности и целей исследования. Ключевое  значение  в конструировании гибридной ДНК несут два фермента.  Первый  -  рестриктаза  - рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. И  второй - ДНК-лигазы - сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Только после  выделения таких  ферментов  создание   искусственных   генетических   структур   стало технически выполнимой задачей.

Этапы генного  синтеза.  Гены,  подлежащие  клонированию,  могут  быть получены  в  составе  фрагментов  путем  механического  или   рестриктазного дробления тотальной ДНК. Но структурные гены, как правило,  приходится  либо синтезировать химико-биологическим путем, либо  получать  в  виде  ДНК-копии информационных  РНК,  соответствующих  избранному  гену.  Структурные   гены содержат только кодированную  запись  конечного  продукта  (белка,  РНК),  и полностью   лишены   регуляторных   участков.   И   поэтому   не    способны

функционировать в клетке-хозяине.

      При получении рекДНК образуется  чаще  всего  несколько  структур,  из

которых только одна является нужной. Поэтому обязательный  этап  составляет селекция и молекулярное клонирование рекДНК, введенной  путем  трансформации в  клетку-хозяина.  Существует  3  пути   селекции   рекДНК:   генетический, иммунохимический и гибризационный с мечеными ДНК и РНК.

Достижения и проблемы современной генетики

На основе генетических исследований возникли новые области знания (молекулярная биология, молекулярная генетика), соответствующие биотехнологии (такие, как генная инженерия) и методы (например, полимеразная цепная реакция), позволяющие выделять и синтезировать нуклеотидные последовательности, встраивать их в геном, получать гибридные ДНК со свойствами, не существовавшими в природе. Получены многие препараты, без которых уже немыслима медицина. Разработаны принципы выведения трансгенных растений и животных, обладающих признаками разных видов. Стало возможным характеризовать особей по многим полиморфным ДНК-маркерам: микросателлитам, нуклеотидным последовательностям и др. Большинство молекулярно-биологических методов не требуют гибридологического анализа. Однако при исследовании признаков, анализе маркеров и картировании генов этот классический метод генетики все еще необходим.

Создание трансгенных растений

Отсчёт истории генетической инженерии растений принято вести с 1982 года, когда впервые были получены генетически трансформированные растения. Метод трансформации основывается на природной способности бактерий Agrobacterium tumefaciens генетически модифицировать растения. Реконструированные штаммы Agrobactrium, содержащие неонкогенные варианты Ti-плазмид и обладающие повышенной вирулентностью, стали основой одного из наболее популярных методов трансформации. Первоначально трансформация применялась для генно-инженерных двудольных растений, однако работы последних лет свидетельствуют, что этот метод эффективен и в отношении кукурузы, риса, пшеницы. Другим широко распространённым методом трансформации, является технология, основанная на обстреле ткани микрочастицами золота (или других тяжелых металлов), покрытыми раствором ДНК. Все выращиваемые ныне коммерческие сорта получены с помощью названных выше двух методов.   

Современный арсенал методов трансформации, однако, довольно обширен и включает такие подходы, как введение ДНК в голые клетки (протопласты), электропорация клеток, микроинъекций ДНК в клетки, прокалывание клеток путём встряхивания их в суспензии микроигл, опосредованная вирусами инфекции и так далее.

Генетические изменённые растения с устойчивостью к различным классам гербицидов в настоящее время являются наиболее успешным биотехнологическим продуктом. Дело в том, что биотехнология позволила совершить такой прыжок, так как оказалось возможным генетически изменять устойчивость растений к тем или иным гербицидам либо путем введения генов, кодирующих белки, нечувствительные к данному классу гербицидов, либо за счет введения генов, обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов растений. К настоящему времени клонированы гены, кодирующие нечувствительные к действию гербицидов ферменты-мишени, что дало возможность получать трансгенные растения, устойчивые к таким гербицидам, как глифостат и хлорсульфуроновым, и имидазолиноновым гербицидом. Изолированы также гены,  которые кодируют ферменты деградации некоторых гербицидов, что позволило получить трансгенные растения устойчивые к фосфинотрицину и далапону. В 1997  году устойчивая к Roundup соя, распространяемая компанией "As Grow", была признана в США сельскохозяйственным продуктом года.

Ученые пошли далее. Так как множество растений подвержены нападению и поеданию со стороны насекомых, то ученые генной инженерии провели эксперимент с давно известной бактерией Bacillus-Thiringiensis, которая продуцирует белок, оказалось она является очень токсичной для многих видов насекомых, но в то же время безопасна для млекопитающих.,  белок  (дельта-эндотаксин, CRY-белок) продуцируется различными штамами Bacillus-Thiringiensis. Это прототаксин который расщепляется в кишечнике насекомых, образуя активированный токсин. Активизированный белок специфично связывается с рецепторами средней кешки насекомых, что приводит к образованию пор и лизису клеток кишечного эпителия. Взаимодействие токсинов с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-насекомое. В природе найдено большое количество штаммов Bacillus-Thiringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты  Bacillus-Thiringiensis в течение десятилетий использовались для контроля насекомых на полях.