МАЛДИ спектроскопия сложных соединений

                                 

^Рис.5

^{Основное правило  приготовления образцов –  это сперва найти растворитель,  в котором полностью растворяется анализируемое вещество (аналит), затем подобрать растворитель для выбранной матрицы,  который будет смешиваться с растворителем аналита.  В некоторых случаях подходящие растворители хорошо известны. При анализе пептидов и протеинов в качестве растворителя используется 0.1% раствор трифторуксусной кислоты (TFA)  в воде,  а для олигонуклеотидов чистая деионизованная вода.  А в качестве растворителя для матриц берут соответственно смесь ацетонитрила с 0.1%TFA  и смесь ацетонитрила с водой.  То в какой пропорции растворители находятся в смеси,  может сильно влиять на выход ионов в МАЛДИ эксперименте. Полный протокол приготовления образца должен включать относительные концентрации растворителей.  Для того чтобы избежать преждевременное выпадение матрицы в осадок, раствор исследуемого вещества всегда добавляется к насыщенному раствору матрицы (типичное отношение объемов 1:10). Получение небольших и однородных кристаллов матрица/анализируемое вещество способствует процессу ионизации, приводит к уменьшению сигнала от матрицы и}

^{стабильному и повторяемому выходу ионов исследуемого вещества. Неоднородная кристаллизация заставляет искать так называемые «сладкие пятна» (“sweet spots”) на поверхности кристалла для получения стабильного сигнала, а также влияет на повторяемость МАЛДИ результатов от образца к образцу. Эти проблемы наиболее ярковыражены в образцах с низким относительным содержанием исследуемого вещества или с высоким уровнем загрязнений.}

^{При работе с  биологическими соединениями часто используются буферные растворы, соли, поверхностно-активные вещества. Эти соединения оказываются в растворе анализируемого образца и могут повлиять на качество спектра. Метод МАЛДИ более толерантен к присутствию примесей, чем другие методы. Если примеси присутствуют в небольших количествах, качество спектра, обычно, не ухудшается, а иногда чувствительность может возрасти за счет образования ионов . В таких случаях (т.е. небольшого количества примесей) образцы можно анализировать без предварительной очистки. Однако, если это возможно, лучше всего удалить соли и примеси до кристаллизации. Ниже приведена пошаговая процедура метода «высушенных капель» для протеинов:}

^{1. Приготовить  раствор анализируемого  образца с концентрацией  100 пмоль/мкл в смеси 0.1% TFA с водой 1:1. (Вспомогательная формула: MW [kDa]/10 дает концентрацию в мг/мл, где MW[kDa]- молекулрная масса белка в кДа, т.е. для белка мелиттин с массой 2.845кДа концентрация 100 пмоль/мкл соответствует концентрации 0.28мг/мл). Так приготовленные образцы могут длительное время храниться при температуре минус .}     

^{2. Приготовить  рабочий раствор  анализируемого образца:  развести раствор образца до концентрации 10пмоль/мл.} 

^{3. Приготовить  свежий насыщенный  раствор матрицы: 10-20 мг порошка матрицы смешать с 1мл растворителя (в данном случае тот же, что и для исследуемого вещества) в 1.5мл эппендорфе и центрифугировать.}

^{4. Поместить 5мкл  супернатанта раствора матрицы в маленький эппендорф и добавить 5мкл рабочего раствора аналита, в результате полученное отношение матрица/аналит будет 5000:1. Тщательно перемешать до получения однородного раствора.}

^{5. Нанести 0.5-2 мкл полученной  смеси на пластину  масс-спектрометра.}

^{6. Высушить при  комнатной температуре.} 

^{Дополнительно кристалл матрица/аналит может быть вымыт для уменьшения нелетучих}

^{солей,  которые могут  сегрегироваться на поверхности кристаллов.  Для этого на поверхность образца на 10-30 секунд наносится капля холодной подкисленной воды, которая затем стряхивается или отсасывается с образца. В случае если для растворения аналита и матрицы используются разные растворители, то раствор образца делают более (~  в 10  раз)  концентрированным,  но берут раствора матрицы приблизительно в 10  раз больше. Преимуществом такого подхода является то, что финальный раствор, в котором смесь матрица/аналит кристаллизуется, почти такой же как и раствор самой матрицы,  а также дополнительное растворение образца приводит к уменьшению влияния примесей на МАЛДИ спектры.}

^{Этот метод  самый простой  и дает хорошие  результаты для многих типов образцов. Нанесенные таким способом образцы стабильны и могут храниться дни в холодильнике или в вакууме до проведения масс анализа. Однако может оказаться, что нужно пробовать другие методы приготовления образцов.}

^{Общее количество образца необходимое  для MALDI анализа зависит  от: типа образца: для пептидов – 1 пмоль/мишень, для белков 5 пмоль/мишень, для гликопротеинов 10 пмоль/мишень, молекулярного веса: чем он больше, тем больше должно быть вещества, чистоты и метода приготовления.}

^{Для “легких” образцов достаточно 10 пмоль /мишень, для “трудных” количество вещества должно быть увеличено. В случае протеинов, их концентрация в финальном растворе должна быть < 10 пмоль /мишень, т.к. большие протеины препятствуют кристаллизации матрицы и могут полностью подавить МАЛДИ сигнал. Уменьшение концентрации – это способ получить лучший результат в МАЛДИ. Общее правило для образцов неизвестной концентрации – начинать с его оригинальной}

^{концентрации  и попробовать  отношения 1:1 и 1:9 его  смеси с матрицей. Так как одновременно на одну мишень МАЛДИ можно нанести много образцов, рекомендуется попробовать серию разбавлений (до 5 шагов) в одно время, и, найдя лучшую степень разбавления, оптимизировать для нее процедуру приготовления образца.} 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

^{Проведение  анализа.}

^{После нанесения  образца на пластину МАЛДИ, она вставляется  в масс-спектрометр  и система откачивается.} 

^{Короткий световой импульс лазера поглощается  молекулами матрицы  и разрушает ее кристаллическую структуру. Часть молекул отрывается от поверхности и образует высокотемпературный суперплотный газ (зона шлейфа), в котором кроме молекул, ионов и ассоциатов матрицы присутствуют молекулы анализируемого соединения. Поскольку энергия лазера поглощается матрицей, молекулы образца оказываются в зоне шлейфа, вгазовой фазе, практически без приращения внутренней энергии, т.е. с сохранением исходной структуры.}  

                          

^Рис.6

^{Положительная ионизация  молекул анализируемого вещества чаще всего  происходит в результате захвата протона или другого катиона , или в результате потери электрона. Отрицательная ионизация происходит в результате захвата электрона или потери протона.}  

^{Нейтральные молекулы и частицы плазмы откачиваются насосами, а образовавшиеся ионы вытягиваются и ускоряются высоким потенциалом (~ 25 кВ) по направлению к анализатору, причем положительные или отрицательные ионы могут регистрироваться при простой смене полярности выталкивающего электрода. После того как детектора достигнет наиболее тяжелый ион, производится новый лазерный импульс, и весь процесс ионизации и регистрации ионов повторяется. Спектры после каждого лазерного импульса суммируются до получения качественной информации о молекулярной массе соединения. Важным моментом эксперимента является возможность направлять каждый последующий импульс в новую точку образца.}

^{В современных  масс-спектрометрах  существуют предустановленные  режимы, оптимизированные для каждого диапазона масс. Чаще всего достаточно выбрать один из таких режимов и дальнейшая настройка прибора сводится к подбору корректной мощности лазерного излучения, которая, в идеале, должна незначительно превышать пороговую мощность появления МАЛДИ сигнала.}   

^{Метод МАЛДИ используется, прежде всего, для  установления точной молекулярной массы соединения. К сожалению, в случае тяжелых веществ определить его точную массу очень трудно. В качестве примера, на рисунке 7 приведен спектр сыворотки бычьего альбумина, снятого в линейной моде. Максимальный пик принадлежит протонированному молекулярному иону, более тяжелый пик обусловлен димером, а более легкие – второму и третьему ионам. Как видно, разрешение для тяжелых белков очень небольшое (R~100).}

^{рис. 7}

^{И хотя для легких белков можно получить спектры с гораздо  лучшим разрешением  и точностью определения масс, этого для успешной идентификации белка недостаточно, поскольку слишком большое количество белков имеют приблизительно равные значения молекулярных масс. В тоже время, набор пептидов (см. Рис.8), полученных  в ходе ферментативного гидролиза исследуемого белка (чаще всего трипсинолиза) уникален.} 

^{рис. 8}

^{Масс-спектр можно  представить в  табличном виде, т.е. как набор пар  значений моноизотопных масс и интенсивностей, и используя такой набор данных можно идентифицировать белок с помощью наиболее распространенного метода peptide mass fingerprinting, пользуясь базами данных в Интернете. К сожалению, этим методом нельзя определить белок в смеси белков.}

  ^{Для определения веществ меньших масс часто достаточно информации о его точной массе и изотопном распределении.} 

^рис.9

^{Например, на рис.9 легко определить пики, соответствующие  ионам пустых фуллеренов –} 

^{и т.д. (хорошо видно  четыре изотопа) и  пики, соответствующие  ионам (на изотопное распределение углерода накладывается изотопное распределение гадолиния). При наличии фрагментации, вещество можно определить и по набору характеристических фрагментных ионов.}

^{Таким образом, МАЛДИ  масс-спектроскопия  является мощным инструментом  для получения информации о точной массе молекул, необходимой для их идентификации, а также для проверки результатов химического синтеза веществ. Из знания точных масс молекулярного иона и фрагментов и их изотопного распределения можно получить информацию о составе и структуре исследуемого вещества. Так как МАЛДИ является очень чувствительным методом, то его также широко применяют для обнаружения искомых веществ очень малых концентраций в исследуемых образцах, что является очень важным, например, при исследовании загрязнений окружающей среды.}

 

 

 

 

 

 

 

 

 

^{Литература.}

                                               

1. ^{M. Karas, F. Hillenkamp, Anal. Chem. 60, 2299  (1988)}
2. ^{K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida,  T. Yoshida, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2, 151, (1988).}
3. ^{А.Т.Лебедев «Масс-спектрометрия в органической химии». Москва, Бином, 2003, с 496.}
4. ^{Wiley and McLaren , Rev. Sci. Instr. 26, 1150 (1955).}
5. ^{Б.А.Мамырин, В.И.Каратаев, Д.В.Шмикк, В.А.Загулин, Журнал экспер. и теор. физики,}   

^{64, 82 (1973).}

6. ^{B.A. Mamyrin, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 131, 1 (1994)}
7. ^{D.Spengler, D.Kirsh, R.Kaufmann, J.Phys.Chem., 1992, 96, 9678}
8. ^{D.J.Pappin, P.Hojrup, A.J.Bltasby, Curr Biol., 1993, 3, 327-332}