Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comanonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфона

Практическая  значимость. Метод, основанный на биосенсорной детекции п-толуолсульфоната и фенола, может быть использован в научных исследованиях для определения концентрации указанных соединений в пробах, не содержащих других компонентов; так, метод может быть полезен при решении задач, связанных с оценкой каталитической активности in vivo ферментных систем микроорганизмов-деструкторов п-толуолсульфоната и фенола в процессе их утилизации.

Разработанные модели биосенсоров могут составить  основу аналитических приборов для проведения экологического мониторинга, основанных на одновременном измерении проб двумя сенсорами, включающими плазмидный и бесплазмидный штаммы, соответственно. Такие системы могут явиться высокоэффективными не только для определения абсолютных значений концентрации поллютантов в образцах, но, в первую очередь, для оценки эффективности процессов, связанных с относительным изменением содержания целевого соединения в образце, например, в процессе очистки сточных вод химических предприятий.

Результаты, полученные при изучении разложения п-толуолсульфоната в лабораторных условиях, могут быть использованы при проектировании промышленных реакторов для разложения ТС и фенола, содержащегося в сточных водах, а также для разработки биосенсора колоночного типа.

Качественная  оценка процесса деградации фенола иммобилизованным активным илом позволила представить  рекомендации по оптимизации очистки сточных вод нефтехимического предприятия, в результате которых была увеличена на 17% эффективность очистки. Предложен метод оценки окислительной активности микроорганизмов активного ила с помощью аналога колоночного сенсора.

Основные  положения диссертации, выносимые на защиту.

Аэробные микроорганизмы-деструкторы  при разложении целевого вещества потребляют кислород. Этот процесс можно использовать при создании микробных сенсоров для детекции целевого соединения. Поэтому поиск штаммов, пригодных для использования в биорецепторах сенсоров целесообразно проводить среди штаммов-деструкторов соответствующих соединений.

Плазмидная  детерминированность катаболизма  целевого соединения позволяет создавать  пару на основе двух вариантов одного штамма, один из которых содержит плазмиду биодеградации, а второй не содержит. В этом случае спектр деградируемых веществ у этих двух вариантов будет отличаться только целевым соединением. Сигнал на целевое соединение в этом случае можно будет отделить от сигналов на мешающие вещества.

Биосенсорный подход применим для решения практических задач с помощью аналога колоночного сенсора на основе бактерий активного ила. Этот сенсор позволяет произвести качественную оценку состояния активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений. Кислородный электрод Кларка применим для оптимизации работы аэрируемых биохимических очистных сооружений промышленных предприятий.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах, содержит  15 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 207 источников литературы.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были доложены на международных и российских конференциях: "Биокатализ-98" (Пущино, 1998), "Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (3-я Научно-техническая конференция, Москва, 1999), Всероссийская конференция с международным участием "Сенсор - 2000" (Санкт-Петербург, 2000), "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" (Оболенск, 2000), "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2001). Всего по материалам диссертации опубликовано 13 работ – 8 публикаций материалов конференций, 3 статьи в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», статья в «Известиях ТулГУ», статья в журнале «Экологические системы и приборы».

2. ОБЗОР  ЛИТЕРАТУРЫ

Биосенсоры  как направление в аналитической  биотехнологии.

Вторая половина 20 века охарактеризовалась интенсивным  развитием биотехнологии и появлением в ней нового направления –  аналитической биотехнологии. В свою очередь значительную роль в развитии аналитической биотехнологии сыграли исследования в области биосенсоров - аналитических приборов, представляющих собой комбинацию биологического материала с физико-химическими устройствами, называемыми преобразователями. Назначением биоматериала являлось обнаружение заданного соединения в пробе, назначением преобразователя являлась регистрация протекающей биохимической реакции и формирование электрического сигнала, свидетельствующего о взаимодействии анализируемого соединения с биоматериалом. Впервые биосенсорный принцип анализа сформулировал американский профессор Л.Кларк в своем выступлении на симпозиуме Нью-Йоркской Академии наук в 1962 г [10]. Он же являлся и автором первой действующей модели биосенсора, предназначенного для быстрого обнаружения глюкозы в пробе. В настоящее время исследования в области биосенсоров характеризуются высокой интенсивностью, направленностью на решение практических задач, поиском биоматериалов нового типа, совершенствованием аналитических параметров [8, 9, 11].

В обзоре во вводной части кратко рассмотрены типы преобразователей и биоматериалов, составляющие основу биосенсоров, вторая, основная часть, посвящена анализу вопроса об использовании клеток микроорганизмов для биосенсорной детекции различных целевых соединений.

2.1. Типы преобразователей, используемых в биосенсорах. Электрохимические преобразователи

При разработке сенсоров используются электрохимические[8-15], пьезоэлектрические [16-18], оптические преобразователи [19-25], магнитные преобразователи [26], химические сенсоры [27-32].

В биосенсорных аналитических  системах широко используются электрохимические преобразователи вследствие простоты исполнения и надежности функционирования. В качестве электрохимических преобразователей используются амперометрические и потенциометрические электроды (Н⁺, СО₂, NH₃⁺ - селективные электроды, ионселективные полевые транзисторы), кондуктометрические ячейки [8, 12]. Рабочий диапазон детекции потенциометрических сенсоров заключен в пределах от 10^-1 до 10^-5 М, амперометрических – от 10^-3 до 10^-9 М [14]. Амперометрический принцип удобен при создании сенсоров на основе аэробных микроорганизмов.

При амперометрическом детектировании измеряемый ток непосредственно определяется скоростью биоэлектрохимической реакции, протекающей на индикаторном электроде [8, 13]. Поверхность амперометрических электродов модифицируется различными способами с целью придания им требуемых качеств и улучшения рабочих характеристик [33]. Для повышения селективности применяется создание специфичных мембран, использование высокоактивных электродных материалов, применение медиаторов [34]. Амперометрические электроды успешно применяются в биологических исследованиях, в частности, в клинической биохимии, где из-за большого числа образцов и необходимости экспресс-анализа многие сложные методы непригодны [8]. Одним из наиболее простых и надежных типов преобразователей является амперометрический метод измерения уровня кислорода в среде. Он широко применяется для создания биосенсоров на основе амперометрического микробных клеток для детекции органических соединений [15].

2.2. Типы биологических материалов, применяемых в рецепторных элементах биосенсоров

2.2.1. Сенсоры на  основе ферментов, иммунных комплексов, молекул ДНК, животных и растительных клеток, клеточных органоидов

Сенсорные системы на основе ферментов широко используются в  медико-биологической практике. Для эколого-аналитического контроля они применяются значительно реже ввиду сложности состава природных и сточных вод и возникающих артефактных сигналов. Кроме того, недостаточно изучено воздействие токсичных соединений на механизм ферментативного катализа. Однако, поскольку ферментные сенсоры обладают высокой селективностью, данное направление является перспективным для экологического мониторинга [34].

Создан ряд  ферментных сенсоров для детекции фенола и его производных; в частности, путем иммобилизации тирозиназы в осмиевом полимере на основе поливинилимидазола [35], на стеклоуглеродном электроде [36, 37], в полиэстерсульфоновой кислоте [38], углеродной пасте [39-42], на поверхности графитового электрода [43], на эпоксиграфитные электроды [44-46], в парафин-графитную среду [47], в трвердографитной пасте [41], в металлоуглеродную пасту [48], на карбамид-активированном электроде [49], на твердом графитном электроде [42], в поливиниловый спирт [50]. Сенсор на основе тирозиназы использовали для определения фенола в проточной системе [51]. Разработан цеолитный сенсор для определения фенола с пределом детекции 0.25×10^-9М [52]. Созданы Биосенсоры, в которых тирозиназа коиммобилизована с другими ферментами, в частности, с хинопротеинглюкозодегидрогеназой [51], глюкозодегидрогеназой [53-55, 39], фенолоксидазой [56], пероксидазой хрена [57], холинэстеразой [58], полифенолоксидазой [59], глюкозодегидрогеназой [50]. Описан фенольный сенсор на основе лакказы [60]. Пределы детекции для фенола и его гомологов составляли от 20×10^-9 до 10^-6 М [37, 46, 49, 50, 61-63]. Время ответа для всех описанных сенсоров составляло несколько секунд. На основе тирозиназы предложен биосенсор, чувствительный к цианидам, хлорфенолам, атразину, ряду пестицидов [64]. Для детекции неорганического фосфата разработаны ферментные сенсоры с нижними пределами детекции 10^-9 М [65] и 6×10^-6 М [66]. Разрабатываются ферментные мультибиосенсоры для одновременного определения глюкозы, этанола, 1-лактата, 1-малата в образцах вина [67], для определения качества рыбных изделий по детекции продуктов распада белков [68, 69].

Принцип действия иммуносенсоров основан на взаимодействии исследуемого вещества (антигена) со специфически связывающимися с ним партнером (антителом) [8]. Эффективное применение иммуносенсоров в области аналитического контроля связано с высокой специфичностью реакции антиген-антитело и практически неограниченным числом соединений, для которых можно выделить иммунные комплексы [34]. К настоящему времени разработан ряд иммуносенсоров для экологического контроля [70, 71, 8]. Предложены модели иммуносенсоров для определения ароматических соединений, сахаров, белков [52, 8]. В частности, для детекции 2, 4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты [72-74], тринитротолуола [75,76] и гексагидро-1, 3, 5-триазина [76], 4-нитрофенола [77], 2,4-динитрофенола в воздухе [22] и в образцах сточной воды [78] и для оценки общего содержания полициклических ароматических углеводородов в почве [79, 73], детекции микроорганизмов (Salmonella) [80]. Разрабатываются иммуносенсоры для клинической диагностики [81], определения инсулина человека [82], цитокинина [83], гербицидов и пестицидов [79, 81, 84], фенилоина и диоксина [85]. Нижние пределы детекции описанных иммуносенсоров составляют до 10^-12М [85]. Описаны иммуносенсоры для детекции неорганических соединений, в частности, нитрата [86, 87] и нитрита [86-88].

Разрабатываются также сенсоры на основе олигонуклеотидов для детекции гибридизации ДНК и общей токсичности [89], клеточных органоидов [90, 91], нервных клеток [26], других клеток животных, в частности, миокардиоцитов цыпленка [92].

2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток

Использование микробных биосенсоров характеризуется  рядом преимуществ: более низкой стоимостью и трудоемкостью изготовления биорецептора ввиду исключения стадий очистки и выделения фермента. В ряде случаев возможно повышение стабильности биосенсора, поскольку ферменты внутри клетки находятся в естественных, оптимальных условиях [93].

Первый микробный  сенсор был разработан Divies в 1975 г для определения этанола с использованием клеток Acetobacter xylinum [94]. В настоящее время разработаны микробные сенсоры для определения широкого спектра соединений.

По своим  параметрам (чувствительности, скорости ответа, воспроизводимости показаний) микробные сенсоры близки к ферментным, однако обладают более низкой селективностью, что обусловлено многообразием ферментативных систем клеток. Решением данной проблемы – повышением селективности - является ингибирование нежелательных метаболических путей и систем путем культивирования с соответствующим субстратом [95]. Незначительные затраты на получение биомассы, а также стабильность рецептора в ряде случаев делают использование микробных сенсоров предпочтительным по сравнению с другими типами биосенсоров.

Микроорганизмами, используемыми в биорецепторе, чаще всего являются прокариоты. Описаны микробные сенсоры на основе бактерий практически всех систематических групп [96], некоторых грибов, в частности Aspergillus ustus [97], одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas [98] и Scenedesmus Subspicatus [99], дрожжей [100]. Разработано большое количество датчиков с использованием микроорганизмов для определения сахаров, спиртов, органических кислот, витаминов, антибиотиков, стероидов, пептидов, ферментативных активностей, аммония, нитратов, нитритов, сульфидов, фосфатов, БПК. Достижения в области микробных сенсоров отражены в книге [8].

Разрабатываются также микросенсоры на основе микроорганизмов, в которых роль электрода играет платиновая проволока диаметром в несколько микрон. Микроскопические сенсоры имеют ряд преимуществ, так, они не нуждаются в перемешивании среды, поскольку диффузия в микроскопических масштабах происходит значительно эффективнее. Следовательно, может быть достигнут более низкий предел детекции [101].

В микробных  сенсорах субстрат для взаимодействия с ферментом должен транспортироваться через мембрану клеток. В связи с этим времена генерации сигналов ответов для микробных сенсоров более высокие, чем для ферментных. Физиологические характеристики микроорганизмов, используемых в биорецепторном элементе микробного сенсора, в частности, дыхательная активность [102], зависят от рН, формируются под влиянием условий лимитирования по субстрату и определяют чувствительность, специфичность и стабильность биорецептора. Электрохимические продукты трансформации химических соединений, осуществляемой ферментативными системами микроорганизмов (H⁺, NH₄⁺, H₂O₂, CO₂ и др.), либо поглощение кислорода, происходящее в процессе реакции, могут быть зарегистрированы электрохимическими методами (амперометрия или потенциометрия). Ответная реакция микробного сенсора на изменение состава среды представляет собой среднее из показателей миллионов отдельных организмов, что обеспечивает наиболее объективные и достоверные результаты [103].